细菌分离培养及鉴定
有氧细菌分离培养、鉴定的方法和手段
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微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
细菌分离培养实验报告
细菌分离培养实验报告
实验目的：
通过对样品的细菌分离和培养，观察和鉴定细菌种类及其生长特征，为日后的研究奠定基础。
实验原理：
细菌分离培养是指将样品中的微生物通过特定的方法分离出来，并且在适宜的培养基上进行培养。
主要步骤包括选择样品、消毒、接种、分离和鉴定。
实验步骤：
1.选择样品：本次实验选用的是口腔拭子样品。
2.消毒：将口腔拭子放入细菌营养液中，充分均匀振荡，将细
菌营养液倒入灭菌瓶中。
3.接种：将灭菌瓶中的细菌营养液，均匀地涂抹在培养基平板上，用铁环进行接种。
4.分离：将铁环进行细菌分离，标记好分离点。
5.鉴定：根据样品的菌落形态、生长特征及其他相关检测方法，进行初步鉴定和筛选，待进一步的鉴定。
实验结果与分析：
在培养基平板上观察到了菌落的生长，初始生长时间为48小时。
根据菌落的形态、颜色、大小和特征等，初步判断菌落为链球菌属（Streptococcus）。
结论：
通过细菌分离培养实验，成功分离出一株链球菌属的菌落，并进行初步鉴定，为日后的进一步研究提供了基础。
细菌的分离、培养和鉴定
生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴动化微生物鉴 Expression： 定和药敏分析系统
分子生物学技术
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核 酸检测技术, 酸检测技术, 包括基因测序、指纹图谱技术、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、 基因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定等。 PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成 PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成 比较经典的核酸检测技术, 比较经典的核酸检测技术, 目前这两者已经 得到了较大范围的推广和应用
具体操作： 具体操作：
• 取病料，将体表的泥沙等杂物用清水冲洗干净 取病料， • 取干净托盘，将病料置于托盘中 取干净托盘， • 托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、接种 托盘置于工作台上，接种前准备好酒精灯、
环、酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。事先作 酒精棉球、解剖刀、剪刀、镊子等。 好准备工作， 好准备工作，把所用的物品器械摆好 • 解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位， 解剖病料，将接种环烧红冷却后接触病变部位， 平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。 平板划线。如体表创伤溃烂部位，病变内脏。腹 水可直接涂布平板 • 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h， 长状况 注意： （注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭 台面，保持操作台的整洁） 台面，
鱼的解剖结构：
2）无菌操作
无菌操作是指在环境中一切有生命活动的微生物的 营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。微生物 研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作 对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须 经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情 况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、 器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事 先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸 30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮 30min，玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮 塞、培养基等则要高压灭菌。
细菌的分离与鉴定题目
细菌的分离与鉴定一、名词解释1、细菌分离及鉴定：使用人工的方法使细菌在适当的环境和营养基质中生长繁殖，获取纯种、进行鉴定与研究等。
2、培养基：人工配置的供细菌生长繁殖的营养基质，是用人工方法将多种营养物质按照各种细菌的需要而组合成的混合营养料。
3、选择性培养基：在培养基中加有出营养成分以外的抑制物质，使之具有选择性，有利于目的细菌的检出和识别，而抑制其他非目的菌的生长或使其生长不佳。
4、鉴别培养基：利用各种细菌分解糖类和蛋白质能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物，观察细菌在其中生长对底物的利用，从而鉴别细菌的培养基。
5、系统鉴定：通过病原菌的形态结构、生长特性、抗原性和病原性等检测，并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型。
6、基因探针技术：用标记物标记细菌染色体或质粒DNA上的特异性片段之辈成细菌探针，待检标本经过短时间培养后，经过点膜、裂解变性、预杂交和杂交后，利用探针上标记物发出的信号可以知道杂交结果并判断杂交结果并判断病原体的性质。
7、毒力：病原细菌的致病能力的强弱。
通常病原细菌的毒力越大，其致病性越强。
8、半数致死量：在一定的时限内能使半数实验动物感染后发生死亡所需的活的细菌量或毒素量。
9、复杂染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法称为复杂染色法。
10、抑制剂：用于抑制非检出菌的生长或使其少生长，以利于检出菌的生长。
二、填空1、培养基的主要成分有营养物质、水分、凝固物质、抑制剂和指示剂。
2、当琼脂含量为1%-2%时可制成固体培养基，含量为0.3%-0.5%时可制成半固体培养基。
3、常用的抑制剂有胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸盐、四硫磺酸盐、叠氮钠、一些染料及某些抗生素等。
4、常用指示剂有酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、甲基红、酸性复红等。
5、鉴别培养基主要供生化反应试验用，如糖发酵培养基、七叶苷培养基等。
6、常用的接种方法有平板划线接种法、斜面接种法、倾注培养法、穿刺接种法、半固体培养基接种法、液体接种法、平板涂布接种法。
细菌培养及鉴定
细菌培养及鉴定
微生物的培养和鉴定是现代医学的重要科学技术和服务,它在临床诊断,分子生物学和生物科技方面有重要作用，是进行细菌分离、鉴定和品种筛选的重要手段。
同时，也是医学上许多治疗、预防和诊断技术的重要环节。
细菌培养和鉴定的步骤包括：第一步，样品的获取和分离，并将获得的纯细菌样本放置到壳斗中；第二步，培养，即复活细菌培养，将细菌培养在特殊的培养基中，未来的培养表现就可以被观察到；第三步，鉴定，判断细菌种类和数量，准备将细菌培养表现比较到已知菌株，从而确定细菌种类。
细菌培养需要恒温恒湿和特定PH值的环境，培养基的选择也是有许多变化的，它可以是常规的抗性別、非抗药和复合培养基，也可以是非常规的培养基，以满足特定细菌种类的需要。
此外，还需要实现细菌表面及毒力活性鉴定，以确定细菌类型及抗性基因，例如抗血清，优势抗生素，和发酵代谢物，以及放射性和分子生物学技术来推测大量细菌信息。
最后，通过上述步骤，细菌培养及鉴定的结果得到正确。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
细菌分离培养与鉴定程序
细菌分离培养与鉴定程序一、背景记录1、猪的临床症状2、不同猪的发病阶段（早、中、晚、解剖前宰杀还是解剖前已死亡）3、解剖病变（保存好照片）二、分离用培养基1、常用培养基：鲜血琼脂培养基、巧克力培养基2、非常用培养基：麦康凯培养基、沙门氏菌选择性培养基三、病料的选取和保存1、首选来自刚宰杀后的活畜禽或死后2-4小时内的畜禽2、得到病料后应该立即进行细菌分离，分离细菌前最长保存时间（在4℃冰箱内）最好不要超过3-4小时。
分离细菌前应将病料保存在4℃冰箱不得放入-20℃冰箱。
分离细菌后如需要根据细菌生长鉴定情况来决定病料用途（需再次接种、需再次触片、需接种动物等等）可先将病料暂存4℃冰箱，但不得超过2天。
一般情况下分离细菌后应及时将需长期保存的少量病料分装到塑料瓶中进行记录保存，多余的病料进行无害化处理。
四、分离路线1、选择分离细菌的目标脏器：根据疑似疾病和病理变化确定，一般选病变比较严重的脏器做为分离细菌的目标脏器，并选择脏器的病健交界处做为细菌分离的最终部位。
一头猪应该选择多个脏器或部位分离细菌。
并对不同部位细菌在整个疾病中的作用有一定的评价，如：心血中的细菌多为全身感染分布的病原；关节、肠道、创口、及肺脏则可能只是局部分布的细菌。
）2、分离细菌一般采用鲜血琼脂培养基划线培养、怀疑存在只能在巧克力培养基上且需要一定二氧化碳才能生长的细菌（如：副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌等）感染时、应同时采用巧克力培养基划线、放到烛缸进行培养。
划线时应该在做到无菌操作的前提下尽量取较大的一块组织或较多量的分泌物、先在培养基表面涂布一小片区域，然后弃去病料再用接种环从涂布区域开始进行划线。
这样一方面可保证分离到病料中的细菌，另一方面也能保证长出单个菌落为进一步鉴定提供方便，同时也为评价病料中细菌含量及不同细菌数量比例的评价提供依据。
如果病料来自病程较长或死亡动物且细菌种类复杂、难以确定病原菌的情况下、可考虑分离细菌的同时取病料接种小鼠、再从小鼠分离细菌，二者互为参考。
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菌 落 精选ppt
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菌落与菌苔
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菌落的三个类型：
1.光滑型菌落（Smooth type Colony） ：又称S 型
2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型 3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又称M型
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S型菌落
2020/8/2
A
>25
<10
B
>25
<25
C
<10
>25
A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本
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常用的培养基种类和用途
哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌
巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑 膜炎球菌和淋球菌用
中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用
SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用
M-H平板—细菌药敏用
TCBS平板—弧菌科细菌用
沙包氏平板—真菌培养用
真菌显色平板—真菌培养用
罗氏培养基—分枝杆菌精选用ppt
7
接种工具
接种针和接种环 ：由三部分组成，即环 （针）、金属柄和绝缘 柄 接种针：用于穿刺接种细菌 接种环：用于固体、液体培养基的细菌 接种
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器具：接种环（上）和接种针（下）
2—5cm
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3
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液
嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收冲集洗标尿本道前口用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
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标本接收原则
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细菌在固体培养基中的生长现象
菌落 ★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形
成单一肉眼可见的细菌集团。 ★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透
明度、湿润度、黏度、溶血性 ★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型
（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物 。
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细菌在半固体培养基中的生长现象
无动力 现象
有动力 现象
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斜面接种法
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接种斜面后菌落生长示意图（菌苔）
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革兰染色
原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形
成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌 由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密， 故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小 ，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，， 因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈 紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含 量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类 脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻 挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍 呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性 菌呈红色。
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R型菌落
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M型菌落
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细菌在液体培养基中的生长现象
混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌
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细菌在液体培养基中的生 长现象：
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细菌在半固体培养基中的生长现象
有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向 外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线 边缘清晰。
细菌培养及鉴定
杭州余杭邦尔医院检验科 钟 剑
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1
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查
2.在抗菌药物使用前采集标本
3.采样时严格执行无菌操作
4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂
5.采样后立即送检
6.送检标本应注明来精源选ppt和检验目的
2
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
冲洗
滤纸干燥 精选ppt 油镜观察
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革兰染色
甲菌
乙 菌
紫紫色色（（GG＋＋）） 初染 媒染 脱色 复染
革结兰晶氏紫 染碘色液步骤乙示醇 意图稀释复红
红色（G-）
革兰染色步骤示意图
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【结果】
细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；
阳性菌——紫色（G+b
阴性菌——红色（G-b)
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细菌接种法
平板划线接种法：
★目的：使混合的细菌呈单个分散生长， 形成单个菌落，以便获得纯菌。
★方法：
★分区划线法：适用于含菌量较多的标本
★连续划线法：适用于含菌量较少的标本
液体培养基接种法
穿刺接种法 :用于观察细菌动力
斜面接种法
倾注培养法:用于细菌计数
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分区划线法(3区) 第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
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连续划线法
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15
细菌培养法
一般培养（需氧培养）： ★培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ★培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养 箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧 罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
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革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
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固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
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32
革兰染色程序
初染
媒染
脱色
复染
冲洗
冲洗
冲洗
结晶紫 1’ 碘液 1’ 95%乙醇 30” 复红 1’
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G+ 球菌
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G-杆菌
Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
柄约22cm
5—8安装环(针)的螺口(约8mm)
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9
操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）
Aseptic area 10-20cm
外焰 内焰 焰芯
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10
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本
沾取标本
接种
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
严格实行核对制度 ：包括姓名、性别、年
龄、门诊号/住院号、病床号、标本类型、容器 、标识、检验目的等。
所有拒收或退回标本均应在登记本上登 记，登记内容包括：病人姓名、病区、床号
送检医师、送检项目、拒收(退回)原因、拒收 时间、经手人等
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5
痰标本涂片染色低倍镜下分类
分级 白细胞（个） 上皮细胞（个）