细菌的接种分离与鉴定
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
细菌分离培养实验报告
细菌分离培养实验报告
实验目的：
通过对样品的细菌分离和培养，观察和鉴定细菌种类及其生长特征，为日后的研究奠定基础。
实验原理：
细菌分离培养是指将样品中的微生物通过特定的方法分离出来，并且在适宜的培养基上进行培养。
主要步骤包括选择样品、消毒、接种、分离和鉴定。
实验步骤：
1.选择样品：本次实验选用的是口腔拭子样品。
2.消毒：将口腔拭子放入细菌营养液中，充分均匀振荡，将细
菌营养液倒入灭菌瓶中。
3.接种：将灭菌瓶中的细菌营养液，均匀地涂抹在培养基平板上，用铁环进行接种。
4.分离：将铁环进行细菌分离，标记好分离点。
5.鉴定：根据样品的菌落形态、生长特征及其他相关检测方法，进行初步鉴定和筛选，待进一步的鉴定。
实验结果与分析：
在培养基平板上观察到了菌落的生长，初始生长时间为48小时。
根据菌落的形态、颜色、大小和特征等，初步判断菌落为链球菌属（Streptococcus）。
结论：
通过细菌分离培养实验，成功分离出一株链球菌属的菌落，并进行初步鉴定，为日后的进一步研究提供了基础。
细菌的接种分离与培养实验报告实验结论
细菌的接种分离与培养实验报告实验结论下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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细菌的接种分离与鉴定
Mac生长试验阳性 肠链球菌属
靛基质-
Mac生长试验阴性
α溶血Optochin S为肺链 R为甲链
β溶血 杆菌肽S为A群链 CAMP试验+为B群链
-b鉴定思路
乳糖-
OX+双糖- 非发酵菌科
鞭毛染色-为黄杆菌属莫拉菌属
h2o2+
OX –双糖+ 肠杆菌科
端鞭毛为假单胞 一根鞭毛为绿脓 周鞭毛为产碱杆菌
灭菌接种环
02
第二区划线
03
灭菌接种环
04
第三区划线
05
灭菌接种环
06
添加标题
密集划线法 此法用于纸片药敏实验培养
添加标题
密集划线法
添加标题
用于药敏实验
细菌在固体培养基中生长表现：
大小 （ mm表示。1mm以内露滴状；1-2mm小菌落。2- -4mm中等大菌落；4-6mm以上称大菌落或巨大菌落） 形状 （圆形、不规则形） 边缘 （整齐、锯齿状） 表面性状（光滑、粗糙、） 隆起度（扁平、隆起、中凸） 颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明） 硬度（干燥、湿润、粘液） 溶血（在血培养基上的表现）
添加标题
细菌分离培养
添加标题
选择适合细菌生长的条件和温度
添加标题
按无菌操作 选择适合细菌生长的培养基 接种量少
+C鉴定思路
乳糖-
触酶+ 微球菌科
O/F试验氧化型 微球菌属
h2o2+
触酶- 链球菌科
血浆凝固酶-
新生霉素敏感试验S 表皮葡萄球菌
O/F试验发酵型 葡萄球菌属
血浆凝固酶+ 金黄色葡萄球菌
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术一、实验目的与要求：（1）掌握从环境土壤、水体、活性污泥等中分离培养细菌的方法;从而获得若干种细菌纯培养技能（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法..（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等..二、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中;不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起;当我们希望获得某一种微生物时;就必须从混杂的微生物类群中分离它;以得到只含有这一种微生物的纯培养;这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化..为了获得某种微生物的纯培养..一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同;而供给它适宜的培养条件;或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长;而抑制其他菌生长的环境;从而淘汰其他一些不需要的微生物;再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物;直至得到纯菌株..三、实验器材1、牛肉膏蛋白胨培养基2、盛9ml无菌水的试管;盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶;1ml和5ml无菌吸管;无菌培养皿；3、接种环;土样;酒精灯等..四、操作步骤1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板;并标明培养基的名称..2、贴标签接种前在试管上贴上标签;注明菌名、接种日期、接种人姓名等..贴在距试管口径2-3厘米的位置..3、点燃酒精灯..4、接种取接种环右手拿接种环如握钢笔一样、在火焰上将环端烧红灭菌;然后将有可能伸入试管的其余部分;均用火烧过灭菌..环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管;先使环接触边壁;使其冷却..取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环;然后将接种环移出菌种管;注意不要使环的部分碰到管壁;取出后不可使环通过火焰..接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线..划线的方法很多;但无论哪种方法划线;其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释;使形成单个菌落..常用的划线方法有下列二种：⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环;先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条;再转动培养皿约70°角;并将接种环上剩余物烧掉;待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线;再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线图A..划线完毕后;盖上皿盖;倒置于温室培养..⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线图 B..划线完毕后;盖上皿盖;倒置温室培养..环灭菌将接种环烧红灭菌..5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上;分别置25℃和28℃温室中培养;待菌苔长出后;检查菌苔是否单纯;也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物;若有其他杂菌混杂;就要再一次进行分离、纯化;直到获得纯培养..四、注意事项1、实验操作过程中无菌操作..。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
细菌的分离纯化和接种实验
环工综合实验细菌得分离纯化与接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：１、为什么湖水用10－4、１0-5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低得浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中得微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在,否则一个菌落就不只就是代表一个个体生长而成得，从而方便计数。
2、为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落得生成产生影响;第二,为了防止培养基中得水分蒸发后凝结在壁上,滴落后影响菌得生长与形态观察;第三，防止培养基干涸。
３、微生物常用接种方式有哪些?进行微生物接种应该注意哪些方面?答:⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种,三点接种,浇混接种，液体接种,注射接种,活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理,接种过程必须在煤气灯旁进行,接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到得器材与菌种培养基有序编号放置,操作时应避免已经灭菌处理得材料用具与周围得物品得接触，往培养基就是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤１、制备细菌稀释液:ﻭ使用5mｌ移液管加４、5ｍl无菌水放入贴有10—3、１0—4、10－5、10-6标签得小试管中,用一根1ml得无菌移液管吸取１0-2得湖水稀释液0、5ml放入贴有1０-３标签得小试管中，1ｍl得无菌移液管吸洗三次以混匀。
然后用另外一支1ｍl得无菌移液管从贴有１0-３标签得小试管中吸取10-3得湖水稀释液0、5ml放入贴1０—4标签得小试管中，吸洗三次以混匀。
同法依次连续稀释六、思考题１、氧化亚铁硫杆菌( Thｉoｂaciｌlｕsfｅrrooxiｄans,Ｔ、f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉与沉积硫内，尤以金属硫化矿与煤矿等酸性矿坑水(pH<4）中最为常见。
其化能自养,专性好氧，嗜酸,革兰氏阴性,,主要利用利用CＯ2为碳源,并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
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13
• 试管培养基接种法
• 琼脂斜面接种法
该法主要用于纯种增菌及保存菌种，也可用 于某些生化鉴定试验如双糖铁培养基的接种。
斜面 培养 基
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14
• 手执塑料杆处
小指夹棉塞
• 试管口离火焰1cm
• 手执试管底露出斜面
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15
操作顺序：
接种环灭菌
勾取细菌
取棉塞 接种
塞棉塞
接种环灭菌
干燥，镜检。
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18
h2o2+
触酶+
微球乳菌科糖-
+C鉴定思路
触酶链球菌科
O/F试验氧化型 微球菌属
血浆凝固酶+ 金黄色葡萄球菌
O/Fhin
血浆凝固酶-
S为肺链 R为甲链
Mac生长试验阴性
β靛溶基血 质-
杆菌肽S为A群链 CAMP试验+为B群链
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4
带菌接种环的正确烧法
• 热导法：从环的根部（靠近柄部）开始烧，通过热传导让 接种环或针上带的菌慢慢受热，直至干燥，最后放在氧化 焰（外层温度高）上彻底灭菌。
• 从还原焰开始法：（内层温度低），带菌的接种环或针直 接置于此不会引起气溶胶喷溅，待完全干燥后再移至氧化 焰部位彻底灭菌。
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• 灭菌接种环
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（3）密集划线法 此法用于纸片药敏实验培养
用于药敏实验
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细菌在固体培养基中生长表现：
1、大小 （ mm表示。1mm以内露滴状；1-2mm小 菌落。2- -4mm中等大菌落；4-6mm以上称大菌落或巨 大菌落）
2、形状 （圆形、不规则形） 3、边缘 （整齐、锯齿状） 4、表面性状（光滑、粗糙、） 5、隆起度（扁平、隆起、中凸） 6、颜色及透明度（黄色、灰白、光泽、透明） 7、硬度（干燥、湿润、粘液） 8、溶血（在血培养基上的表现）
2
• 微需氧培养法
适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌培养。 可采用抽气换气法。
• 厌氧培养法
适用于专性厌氧菌培养。 厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸 盐法等。
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3
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本
接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
黄杆菌属莫拉
菌属
一根鞭毛为绿脓
周鞭毛为产碱杆菌
IMVC
+ + - -为大肠
-- + +为产气和肺克
-+ - +为沙门
D + - -为志贺
PD 葡萄糖酸盐
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20
实验安排：
• 每人一个营养琼脂平皿做划线分离，要求分出 单个菌落。（培养时倒置）
• 每人一支营养琼脂斜面做斜面接种。
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21
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标记
培养。
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16
细菌分离培养
选择适合细菌生长的条件和温度
按无菌操作
选择适合细菌生长的培养基
接种量少
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革兰氏染色法步骤
一般包括初染、媒染、脱色、复染
1）涂片干后加热固定。 2）结晶紫染30s，水洗 3）加碘液约30s，水洗 4）加95%酒精数滴，摇动脱色，30秒-1 分钟，至无紫色脱落为止，水洗 5）加复红染色染，染30秒后，水洗。
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7
平板划线法
（1）连续划线法
此法多用于含菌量相对少，无菌部位 来源的如血液，胸腹水，脑脊液等标本的 细菌分离培养。
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8
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9
（2）分区划线法（可分二区，三区和四区）
此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁 等标本的细菌的分离培养。
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10
• 第一区划线 • 灭菌接种环 • 第二区划线 • 灭菌接种环 • 第三区划线
5
接种方法
平板划线法
原则和目的：通过划线稀释细菌 获得单个菌落
• 要领：
G 划线均匀而细密，不重复。 A 充分的利用培养基的面积。 B 培养基不能划破。
GB 培养时培养皿倒置。
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6
培养时培养皿倒置的原因
一 防止培养基的水分蒸发 二 防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌 三 倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延，好形 成单个菌落，利于计数 四 防止外来的污染
细菌的接种、分离与鉴定思路
邵阳市第一人民医院检验科 罗甫花
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1
常用细菌培养方法
• 需氧培养法（一般培养）
适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。 培养温度：37℃（采用恒温培养箱）。 培养时间：18～24h。
• 二氧化碳培养法
适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。 可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。
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新生霉素敏感试验R 腐生葡萄球菌
新生霉素敏感试验S 表皮葡萄球菌
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-b鉴定思路
Ox+双糖发酵型 OX+双糖-
乳糖- 弧菌科
S0为/1弧2h菌92R属o为2和+气霍单乱胞弧菌菌
非发酵菌科
Ox-双糖非发酵菌科
动力-NIT-不动杆菌
OX –双糖+ 肠杆菌科
动力+NIT+嗜麦牙单胞菌
鞭毛染色-为 端鞭毛为假单胞
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