细菌地分离培养及培养性状地观察
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验五真菌的分离培养及形态观察
实验五真菌的分离培养及形态观察真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。
同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。
目的要求1．掌握真菌分离培养方法。
2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。
3．了解真菌载片培养法。
4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。
操作步骤—、真菌的分离培养方法（－）平板划线分离法1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。
2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。
3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。
4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。
如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。
另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。
（二）稀释分离法1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。
取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。
2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。
注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。
3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。
然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
二．真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。
细菌的分离培样及鉴定
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注意事项：
A 划线前先将接种环稍弯曲，使其和平皿内琼脂面平行，不 致于划破培养基。
B 划线中尽量不要重复、往复划线，以免形成菌苔。 C 划线接种完毕，在平皿底部写上菌名、日期和接种者等标
记，然后倒扣培养。
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2、厌氧分离培养
1、接种方法与需氧菌分离接种方法相同，仅培养条件发生 变化。
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B 抹片： 液体材料：如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接
用灭菌接种环沾取一环材料，在载玻片中央均匀涂布成适 当大小的薄层。
非液体材料：如菌落、脓、粪便等，现用接种环取少量生理 盐水置于载玻片中央，然后在用灭菌接种环沾取少量材料 ，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。
组织脏器材料：可先用镊子夹持中部，然后用灭菌剪刀剪去 一小块，用其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成一薄层。
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物理学方法：
* 原理：利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或 隔绝环境及培养基中的氧气，使空干燥器法、高层琼脂法、 加热密封法等。
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3、纯培养与移植
*培养皿接种到斜面、单菌落接种到增菌肉汤、穿刺培养。
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21
3、细菌染色方法
染色方法主要有革兰染色法、美蓝染色法、抗酸染色法、瑞 氏染色法和姬姆萨染色法。
以下以革兰染色法为例简要介绍操作方法。
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22
革兰染色法：
* 原理：机理仍不清楚，一般认为与细菌细胞壁的结构和化 学成分有关。
革兰阴性菌细胞壁含有较多的脂类，当以95%酒精脱色时 ，脂类被溶去，使细胞壁孔隙变大，尽管酒精处理能使肽 聚糖孔隙变小，但因为肽聚糖含量较小，细胞壁收缩有限 ，故能让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被酒精洗脱出 细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。
细菌的分离培养与培养性状观察
冷至约 ５ ０ ￣ Ｃ， 用接 种 环取 一环 培 养物 于 第 一管 内 ， 随
即用两手掌心搓转振荡 ， 由第一管取入第二管 ， 搓匀 又从第二管取出一环至第三管振荡后 ，分别倒入 ３ 个 灭 菌 空平 板 内 ， 摇 匀待 凝 固后 ， 倒 置于 ３ ７ ℃温箱 内 ‘ 培养 ， ２ ４小时后观察结果 。第一个平板菌落最多 ， 第 二个 、 第三个递减 ， 可得到单个菌落 。
约５ ０克置于密封容器内与接种的厌氧菌共 同培养。 焦 性 没食 子 酸 法是 利 用 焦 性 没食 子 酸与 碱作 用
板盖使 之 成 １ 条狭 缝 ， 并靠 近火 焰 旁 。右 手持 接种 环
克， １ ０ ％氢氧化钠或氢氧化钾 １ ０ 毫升。 常用方法有试 管培 养 法 ， 干 板 培养 法 ， 干燥器 培养 法 。 二 氧 化 碳 培 养 法 利 用 少 数 细 菌 如 牛 型 布 氏 杆
菌 ，在含 有 ５ ％～ １ ０ ％的二 氧化碳 环境 下生 长 良好 ， 常 用 的方 法 为 烛缸 法 。取 干燥 器 （ 盖 口抹 上 凡上 林 ） ， 将 接种 好 的平板 或 斜 面放 入 器 内 ，点 燃 燃烛 直 立 于 缸 的隔 板 上 ， 盖上盖子 ， 因器 内氧 气 耗 尽 蜡 烛 自灭 ，
１ ～ ２ 毫米者为小菌落 ； ２ ～ ４ 毫米者为 中等大菌落 ； ４ 毫 米或 更 大者 为大 菌 落或 巨大 菌落 。菌落外 形 有 圆形 、 不 规则 形 、 卷毛状 、 根 状 等 。隆 起 度呈 扩 散 、 台状 、 凸
起、 乳头 状 、 突脐 状 、 覆轮 状 等 。边缘 如整 齐 、 缺刻 状 、 圆锯齿 形 、 波 状 裂 片状 、 镀 边 等 。观察 菌 落 表 面是 否 光滑 、 皱褶 、 颗 粒状 、 同心环 状 、 龟 裂状 等 。表 面光 泽
(完整版)实训大纲
会宁职业中等专业学校养殖专业（模块版）生农实验实年月《畜禽疫病防治》实训大纲一、性质与任务本课程是中职养殖专业的一门重要基础课。
它以化学、生物化学、家畜解剖生理学为基础，通过学习本课程，为学习兽医药理学、家畜病理学、家畜传染病学和兽医卫生检验等奠定基础。
实施本课程的教学是使学生运用辩证唯物主义观点去认识畜禽疾病的本质，掌握畜禽传染病的微生物学检查，为诊断、防治动物传染病提供科学的理论依据。
二、适用专业3年制中职养殖专业。
三、教学目标通过本课程的教学实训，使学和基本掌握以下技能：1.学会显微镜油镜的选用及细菌形态结构观察。
2.掌握实验室常用仪器的选用与保养。
3.学会细菌标本片制备和染色法。
4.学会培养基本制备。
5.学会细菌的分离、移植和微生物学检查。
6.学会细菌药敏试验操作技术。
7.学会实验动物的人工接种和剖检技术。
8.学会应用血清学试验诊断畜禽传染病。
五、实训内容实训一显微镜油镜的选用及细菌形态结构观察(一)实训目的能利用显微镜油镜观察细菌的基本形态和特殊结构，熟悉显微镜的保养。
(二)材料用具1.材料香柏油、二甲苯、擦镜纸和细菌染色标本片。
2.用具生物显微镜。
(三)实训内容1.油镜的选用方法。
2.细菌基本形态的观察。
(四)实训报告布置实训报告，画出所观察的细菌形态。
(五)考核办法实训成绩以100分计，其中，实训态度占10分,操作能力占40分，实训结果占20分，实训报告占30分。
实训二微生物实验室常用仪器的选用与保养(一)实训目的要求学生掌握微生物实验室主要常用仪器的选用与保养方法。
(二)材料用具恒温培养箱、普通冰箱、干热灭菌箱、高压灭菌器、离心机、振荡器。
(三)实训内容恒温培养箱、普通冰箱、干热灭菌箱、高压灭菌器、离心机、振荡器选用与保养方法。
(四)实训报告布置实训报告，写出高压灭菌器选用注意事项。
(五)考核办法实训成绩以100分计，其中，实训态度占10分,操作能力占40分，实训结果占30分，实训报告占20分。
微生物的分离和纯培养
通过研究固氮微生物，提高作物的氮素供应，提 高产量。
在医学上的应用
01
02
03
抗生素
许多微生物可以产生抗生 素，用于治疗细菌感染。
疫苗
许多疫苗是通过微生物培 养制备的，用于预防疾病 。
诊断试剂
微生物可用于制备各种诊 断试剂，用于疾病的快速 诊断。
在工业上的应用
食品加工
微生物在食品加工中起到 重要作用，如发酵、制作 酸奶、面包等。
划线分离
通过在固体培养基表面划线，使微生物在划线区域内独立生长，形成 单菌落。
液体培养基分离
将微生物样品接种到液体培养基中，通过控制培养条件和接种量，使 微生物在液体培养基中独立生长。
03 微生物的鉴定
形态学鉴定
总结词
通过观察微生物的形态、大小、 颜色等特征进行鉴定。
详细描述
利用显微镜观察微生物的形状、 大小、排列、运动性等特征，初 步判断其种类。
纯培养可以研究微生物的代谢途径、 酶活性、生长繁殖条件等特性，有助 于深入了解微生物的生物学特性。
纯培养的方法
选择性分离
根据微生物的特殊性质，如对营养的需求、耐受力、生长温度等，在 选择性培养基上分离出单一的微生物。
稀释与涂布
将微生物样品进行适当的稀释，然后涂布在固体培养基表面，通过控 制稀释度和涂布量，使微生物在培养基上独立生长。
琼脂平板保存法
将微生物培养至琼脂平板上， 待菌落长成后，密封保存。
糖发酵管保存法
利用微生物对糖类的发酵作用 ，将微生物保存在含有糖类的
培养基中，常温下保存。
05 微生物的应用
在农业上的应用
生物肥料
微生物肥料中的有益微生物能加速土壤中有机质 的分解，促进作物对营养元素的吸收。
实验二 细菌分离培养与培养性状观察3.28
目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得 纯菌。
一、目的要求 一、常用的细菌培养方法
1、需氧菌分离培养法
（1） 平板划线分离法
方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量较少的标本。
一、目的要求 1、常用的细菌培养方法
（1）需氧菌分离培养法
1. 平板划线分离法
方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
一、目的要求 （一）常用的细菌培养方法
2、厌氧菌分离培养法
（1）肝片肉汤培养法 ） （2）焦性没食子酸法 ）
一、目的要求 （一）常用的细菌培养方法
3、兼性厌氧菌分离培养法
• 有鞭毛细菌： 有鞭毛细菌： – 在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘 在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长， 模糊。 模糊。 • 无鞭毛细菌： 无鞭毛细菌： – 只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。 只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。
无动力 现象
有动力 现象
思 考？
1、细菌分离培养的目的是什么？何谓纯培养？ 2、培养皿培养时为什么要倒置？ 3、描述接种细菌在液体培养基、固体培养基中 的生长表现。
接种环境
VS-1300VS-1300-U型洁净工作台环沾染的细菌， 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本
接种
灭菌接种环
杀灭接种环沾染的细菌， 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
一、目的要求 （一）常用的细菌培养方法
1、需氧菌分离培养法
（1）平板划线分离法
菌落
菌苔
菌落与菌苔
、目的要求 一（三）细菌在培养基上的生长表现
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如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。
7. 琼脂平板涂布分离法 被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取
1～2 滴置于平板中央，用灭
菌的 L 形玻棒作均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分
区划线。如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙
1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，
此法是借助将蘸有
混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线， 使混杂的微生物细胞在平板表面分散， 经
培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培
养基必须事先倾倒好， 需充分冷凝待平板稍干后才可使用； 为便于划线， 一般培养基不宜太
纯培养。
6. 琼脂斜面分离法
取琼脂斜面 3 管，用接种环蘸取欲检病料少许 （如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解
剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织）
，混合于第 1 管的凝集水中，再作
斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第
2 管、第 3 管斜面上作同样划线。划毕，
置 37℃温箱中培养。经此法分离培养后，第 2 管的菌落较第 1 管为少，第 3 管的菌落更少，
通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，
在平板边缘空白处接触一下使接
种环冷却， 然后从接种细菌的部位
图 4-1 连续划线法
图 4-2 分区划线法
在平板上自左向右轻轻划线， 划线 时平板面与接种环面成 30～ 40 度
角，以手腕力量在平板表面轻巧滑
动划线，接种环不要嵌入培养基内划破
培养基，线条要平行密集，充分利用平
5. 实验动物分离法 被检病料中疑有某种病原菌存在， 可将病料以无菌操作取出， 放入灭菌乳钵或组织匀浆 器内，加 3～ 5 倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下 或静脉）入易感实验动物 ,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑 有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后， 再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌， 可得到
2. 倾注平皿分离法
被检材料若含有两种或两种以上细菌时 ,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后
,
分散的细菌就据材料中存在菌数
的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。其具体方法如下：
取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约
50 ℃，用火焰灭菌接
种环钓取待分离物接种至第一管内， 充分摇匀后， 自第一管取一接种环内容物至第二管， 以
同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于 温箱内培养 24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个 平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待
冷却后放置接种架上。 培 养皿倒置于适
宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板
上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片
镜检为纯种后再接种斜面。
图 4-3 划线分离示意图
(2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划
线法”相似。分区划线法划线分离时平
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实用标准文案
板分 4 个区， 故又称四分区划线法。 其中第 4 区是单菌落的主要分布区， 故其划线面积应最 大。为防止第 4 区内划线与 1、2、 3 区线条相接触，应使 4 区线条与 1 区线条相平行，这样 区与区间线条夹角最好保持 120 度左右。 先将接种环蘸取少量菌在平板上 1 区划 3-5 条平行
离出纯的病原菌。 细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，
然后钓取可疑
菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求
1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法
线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动
60～ 70 度。灼烧接种环，待在平板边缘上冷
却后， 再按以上方法以 1 区划线的菌体为菌源， 由 1 区向 2 区作第 2 次平行划线。 第 2 次划
线完毕， 同时再把平皿转动约 60～ 70 度，同样依次在 3、4 区划线。 划线完毕， 灼烧接种环，
关上皿盖，倒置于 37℃恒温箱中培养 24h 后，在划线区观察单菌落。
学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。 （ 2）杀菌作用 将病料如结核病料用 15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核
杆菌因具有抗酸性而存活。
（ 3）鉴别作用 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某 种细菌。例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
实用标准文案
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察
在细菌学检验中， 细菌的分离培养是重要的基本技术之一。 从混杂微生物中获得单一菌 株纯培养的方法称为分离； 纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞
分裂、 繁殖而产生的后代。 分离培养的目的在于从被检材料中， 或者从污染的众多杂菌中分
薄，每皿约倾倒 20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划
线法（图 4-1）和分区划线法（图 4-2）两种。划线法示意图见图 4-3。
（ 1）连续划线法
以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。 将菌种
点种在平板边缘一处，取出接种
环，烧去多余菌体。 将接种环再次
37 ℃
3. 芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于
80℃水浴箱中维持 15～ 20 分钟，或 85℃加热 10 分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的 细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
4．利用化学药品的分离培养法 （ 1）抑菌作用 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制 作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离， 例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化