干扰素基因的克隆与表达1

（）其它主要试剂 ２
ＰＧ００ ＰＳ 胰蛋白 ＥＴ， Ｏ 姬姆萨染料均为Ｓｇａ Ｅ８０， ， Ｂ 酶、 ＤＡ ＤＳ， Ｍ ｉ 公司产品 其它无机盐均为 ｍ ，
Ｓｇａ ｉｍ 公司产品．
（）主要溶液的配制 ３
ａ ）培养液 ＤＥ 粉末 １． ａＣ３ ｇ ｇ ＮＨ０ ３７ ＭＭ ３４， ． ，双抗 ＩＭ 原浓度 １００ｕｍ 青稼素＋１００ｇｍ 链霉 ＯＬ（ ００ｌ／Ｌ ００ｍ／Ｌ
蛋白 ， 酶、 酶Ｋ ＲＡ 溶菌酶等购自 Ｎ 宝生物工程有限公司、 华美生物工程公司、 ｒｍｇ 公司、 Ｐｏｅａ 原平 皓公司及北京化学试剂公司。
（） 培养基 １Ｌ Ｂ
在９０１ ５ｍ 去离子水中溶解
细菌培养用 胰蛋白 ｂｃｏｔ ｐ ｎ） 陈（ ｔ ｒ ｔ ｅ ａ － ｙ ｏ ｌ ｏ ｇ
内含子和三个外显子，总长 ５ｂ Ｋ 左右。将 ＰＩＮ ｏＦ Ｙ 基因克隆到真核表达载体ＰＩｎ。 Ｃ－ｅ 载体中，组
装成真核表达载体 ＰＩｎｏＰＩＮ Ｃ－ｅ－ｏＦ Ｙ 。利用脂质体转染法将重组载体 ＰＩ ｅ－ｏＦ Ｙ Ｃ－ ｏＰＩＮ ｎ 转染入仓 鼠卵巢细胞 （Ｈ ）中，在 Ｇ１ 的存在下进行筛选培养，获得转染细胞系。 ＣＯ ４８
胰蛋白酶０５ 无钙镁 ＰＳ ． ， ｇ Ｂ 溶液 ２０Ｌ ０ｍ，过滤灭菌，－２℃保存。 ０
ｅ ）胰蛋白酶／ＤＡ ＥＴ 消化液 ＮＣ ０８ Ｋ １． ， Ｃ３ ０ｇ葡萄糖 ０ １， Ａ． ， Ｃ００ ｇＮＨ０ ． ， ａ ｌ ｇ ． ， ４ ａ ０ ５ ． ＥＴ００ｇ胰蛋白酶 ００８ Ｍ ｌ－ 超 ｇＤ ２ ．５， ｌＱ ｉ
（） ＣＣｘ ３ １ ａ１ Ｍ
在２０１ 溶解 ５ｇａ１＂ ， ．２ ｍ ０ｍ 纯水中 ４ＣＣ， ２ 用０２ ｕ 滤器过滤除菌， ６０ Ｈ 分装成 ｌ ｌ ｏ 每份， ｍ 贮存 于一０ 。 ２０ 制备感受态时， Ｃ 取出一小份解冻并用纯水稀释到 １０１ 过滤除菌，℃预冷备用。 ０ｍ， ０
在 ８０ｌ ０ｍ 水中溶解 ２２２ＮＣ，加水定容到 １。分装后高压灭菌。 ９．ｇａｌ Ｌ
（） ｉ ｌ ５ ＬＣ ９ Ｍ
在８０ｌ ０ｍ 水中完全溶解３２０ｇｉｌ ２ｚ ０．５ＬＣ ・Ｈ ，定容到 １，高压灭菌。 Ｏ Ｌ
（０ Ｅ缓冲液 （Ｈ ． Ｔ １） Ｐ８０ ）
（２ ＸＴＥＴ ｉ－ ５ Ｂ （ｒｓ翻酸） １）
５ｇｒｓ ２ ５ 硼酸、 ０１．Ｍ ＡＰ８０，用水溶解后定容到 １． ． ４Ｔｉ 碱、 ７ ｇ ２ｍ０５ ＥＴ（ ． Ｄ Ｈ Ｌ 室温保存。出
现沉淀后则予以废弃。
（３ １）质粒提取溶液
溶液 Ｉ ５ Ｍ ｍ 葡萄糖、２ Ｍ ｉ ・ ｌＰ８０， Ｍ Ａ ８０，高压灭菌， ℃保存． ：； ｌ ５ Ｔ ｓ Ｃ （ ．） ｌ ＥＴ （ ．） ｍ ｒ Ｈ Ｏ Ｄ Ｐ ｍ Ｈ ４
中国农业大学硕士学位论文
实验 部分
第二部分 实验部分
实验一 猪干扰素一 ＰＩＮ 基因的扩增、 ￥Ｃ Ｆ Ｙ） Ｏ 真核载体构建及其在仓鼠
卵细胞中的表达
摘要 从猪的 肝脏组织中提取出 组ＤＡ 以 基因 Ｎ， 其为模板通过长链ＰＲ Ｃ 扩增出 干扰素－ 全基因。 Ｙ 经过核营酸序列测定， 证实其与 Ｇｎａｋ中 ｅＢｎ 发表的 猪千扰素一 基因 Ｙ 序列完全相同， 都包括四个
１ ．实验材料和实验方法
１ １ 材料 ． １ １ １ 质粒及菌种 ． ． ＰＩｎｏｃＩ 质粒、 ｈＦ Ｙ Ｃ－ｅ－ Ｎ 大肠杆菌菌株Ｄ５ Ｈａ 由中国 农业大学生物技术国家重点实验室提供。 １ １ ２ 试剂及配制 ． ．
各种生化试剂、 ｈ Ｉ Ｎｔ ＥｏＩ Ｂｍｌ ＤＡ ｋｒ， 噬菌体 ＤＡ ｘｏ ｏ Ｉ ｃＲ， Ｈ， ｍｒｅｓ Ｔ 、 、 ａ Ｎ ａ ４ Ｎ 连接酶、 ＮＰ， ｄＴｓ
０ ５ Ｓ Ｓ． ． Ｄ ％
（３ Ｃ ａｋ ｎ 缓冲液 ２） ｃ ｉｇ ｒ
０２ｏ／ ａＨ ０ ％Ｄ， 蔗糖溶液。 ＮＯ， ５ＳＳ２％ ． ｌＬ ｍ ． ０
１ １ ３ 细血培养所孺材料 ． ． （ ＤＥ 粉末、双抗为 Ｇｂｏ ＭＭ １ ） ｉｃ 公司产品，胎牛血清 （Ｃ）国产为天津动物血清厂生产，进口为 ＦＳ Ｈｃｏｅ ｙｌｎ 产品，直径 ＩＯｍ ３二 培养皿及细胞冻存管均为Ｃｒｉｇ Ｎｎ 公司产品。原 Ｏｍ ， ５ ｏｎｎ Ａ ｃ ｕ 代仓鼠卵巢细胞由自己实验室提供。
ｈ ）姬姆萨干液
姬姆萨粉末。５ ， ． ｇ加少量甘油将姬姆萨粉末在研钵中 充分磨碎，再加入甘油至总量为２ｍ， ２Ｌ５ ６
℃保温 ２小时，加入 ３ｍ 纯甲醇，保存于棕色瓶中。 ３Ｌ １ １ ４ ． Ｐ Ｒ扩增猪的 工ＮＲ所设计的引物 （ ． Ｃ Ｐ－ 由上海生物工程公司合成）
素） Ｌ ｌ－ 超纯水定容，灭菌，４ 保存。使用时加 １％ＦＳ ． ＂ Ｃ ０ Ｃ．
ｂ ＤＢ 液 ） Ｓ Ｐ
ＰＳ １ Ｍｌ Ｑ Ｂ 粉末 ９７， ｉｌ 超纯水定容，Ｐ ７０７２过滤灭菌，４ ．ｇ Ｌ － Ｈ －． ． ， ℃保存。
（） Ｔ ｉ Ｃ （Ｈ ． Ｐ７６ ６ １ ｒ ｓ・ ｌ ８０和 Ｈ ． Ｍ Ｐ ）
在 ８０ １ ０ｍ 水中溶解 １１ＩＴ ｉ 碱， ２． ｒｓ 加入浓盐酸调 Ｐ 值至 ８０ ｍ ｇ Ｈ ． ２ １ （ ４ 浓盐酸） ７６ ｍ 和 ． ０ １ （ ６ 浓 盐酸） １，分装后高压灭菌。 。定容到 Ｌ
（５ Ｎ 酶溶液 ＲＡ １）
将胰 ＲＡ ｌ Ｍ ｉ ・ ｌ ． ５Ｍ ｌ 配成 １ ｇ ｌ Ｎ 酶溶于 Ｏ Ｔ ｓ Ｃ （ ７６、１ ＮＣ 中 ｍ ｒ Ｐ ） ｍ ａ Ｈ Ｏ ／ 的浓度，１０ 加热 ｍｍ ００ Ｃ １ 分钟，缓慢冷却到室温，分装成小份保存于一０ ， ５ ２０ Ｃ
Ｐｉｅ ： Ｇ ＣＣＡ ＴＡＡＣＧＴＴＧＡ ３， ｒｍｒ工Ｓ Ｃ ＧＧ ＧＴＡＣＡＴＣＧ 引物中含有 Ｘｏ 酶切位点． Ｔ Ｃ ｈｌ
Ｐｉ ｒＩ５ Ａ ＧＧＣＧ ＡＡＴＴＧＴＡＧＣ 。 物中含有Ｎｔ 酶切位点． ｒｍ Ｉ： Ｔ ＧＣＣ ＧＣＴＣＴＧＴ ３ 引 ｅ ｝ Ｃ Ｇ ｝ ｏｌ
中国农业人学硕士学位论文
纯水定容至 Ｉ ｍ ．过滤灭菌，分装，－２ １保存。 ＯＬ Ｏ ０ Ｃ
ｆ ）细胞裂解液
ｌｍ Ｔ ｉ．ｌＰ ．）０ １ Ｅ ＡＰ ．）０５ Ｄ ， （ ８０，．Ｍ Ｔ （ ８０，．９ＳＳ ＯＭ ｓＣ Ｈ ｒ Ｄ Ｈ ６
９ Ｂ液 Ｓ ）Ｔ ＮＣ８Ｏ Ｃ０２ ｒｓＣ３ ｇ溶于１ 重蒸水中 高压灭菌。 Ｋ１． Ｔｉ． ０， ａ１． ｇ， ｇ ， １． Ｌ ，
（１ ２ ）蛋 白酶 Ｋ
旦 绝 里 巨里里绝里里里里巴里 绝里里
中国农业人学硕士学位论文 ２ｍ ／ ｌ ０ ｇｍ 溶于水，－ ０ 保存。 ２＂ Ｃ
（２ ２ ）基因组抽提缓冲液
实验部分
１升溶液 中含有 １ｍｏ／ Ｔ ｉ．ｌＰ８０，．ｍ ｌＬ Ｔ （ ８０，０ｇ Ａ ／ Ｏｍ ｌＬ ｓｃ （ ．）０ ｌｏ／ Ｅ Ａｐ ．）２ｍ Ｒ ％ Ｌ和 ｒ Ｈ Ｄ Ｈ Ｎ
中国农业大学硕士学位论文
旦旦旦旦旦里生旦里里里里里里里里里里里里里里里里里里里巴巴旦里里里里里里里里里里里里里里里里里里里巴巴 巴 巴 巴巴巴 思 巴 巴 巴 里生 巴巴巴 巴 巴 巴巴 巴口 旦旦里巴 巴 巴 日 日 巨 巴 巴巴 曰 口
实验部分
在 １０ｌ ６ｍ 水中溶解 ４ｇａＨ ０ＮＯ，定容到２０ｌ ０ｍ，高压灭菌。
（） ＮＡ （Ｈ ． Ｐ ７０ ４ ３ ａ ｃ ５２ Ｈ ． Ｍ Ｐ 和 ）
在８０ｌ 溶解４８ｌ 三水乙 ０ｍ 水中 ０． ｇ 酸钠， 用冰乙 酸调Ｐ 值至５２ Ｈ ． 或用稀乙 酸调Ｐ 值至７０ Ｈ ．， 加水定容到１， 分装后高 Ｌ 压灭菌。
（） Ｎ Ｏ ５ ５ ａＨ Ｍ
实验部分
１ ．２ 实验方法
１ ２ １ 基因组 ＤＡ的提取 ． ． Ｎ
１ 取 １ｇ ） ５ 新鲜猪的 肝脏， 剪碎， 放入己 灭菌的 研磨锅中 研磨． ２ 当研磨成肉 ） 糜时， 加入液氮， 迅速进行研磨， 反复多次， 直到磨成粉末． ３ 把研磨成的粉末加入到 １０ｌ ） ５ｍ 抽提缓冲液中， 轻轻摇晃， 搅拌。 直到粉末全部进入液体中并均
（９ ０ Ｄ １ ％Ｓ Ｓ １）
在９０ 水中 ０ｍ ｌ 溶解ＳＳ０ｇ Ｄｌ ，加热至６０助溶， ０ ８ Ｃ 加入儿滴浓盐酸调Ｐ 值至７２ 加水定容 Ｈ ．，
到 １ ，无需灭菌，分装备用。 Ｌ （０ ｘ凝胶加样缓冲液 ６ ２ ）
０２％ ．５ ．５ 澳酚蓝、０２％二甲 苯青Ｆ， （ ｖ蔗糖水溶液。 ℃保存。 Ｆ ４％ ） ０ ｗ ／ ４
ｌｍ Ｔｉ ・ Ｉ ． ｍ ＤＡＰ ．） （ ８０、１ ＥＴ （ ８０，高压灭菌． ＯＭ ｓ Ｃ Ｈ ） Ｍ ｒ Ｐ Ｈ
（１ Ｔ 缓冲液 ＳＥ １）
Ｏ１ ＮＣ Ｉｍ Ｔ ｓ Ｃ （ ８０、１ ＥＴ （ ．）高压灭菌． ． Ｍ ｉ ・ ｌ ． ｄ ＤＡＰ８０， ．Ｍ ｌ Ｏ ｒ ａ Ｐ ） （ Ｈ Ｈ
细 培 用 提 物（ｃ － ａ ｘ ａ ） ｇ 母 取 ｂ ｔ ｙ ｓ ｅ ｒ ｔ ５ 菌 养 酵 ａ ｏ ｅ ｔ ｃ ｔ
Ｎ Ｃ ａ ｌ ｌｇ ｏ
用 ５ ＮＯ 约０２ｌ Ｈ （ ． 调Ｐ 值至７４ 加入去离子水定容到 １，高 Ｍ Ｈ ａ ｍ） ．， Ｌ 压灭菌 （ Ｌ 固体培养基 ２ Ｂ ） 按上述配方配制Ｌ 培养基，临高压灭菌前加入细菌培养用琼脂 １ｇＬ Ｂ ５／， 上面两种培养基经高压灭菌冷却到５ ０ ℃后加入抗生素， 即可制成选择性培养基。 氨节青霉素 工作浓度为 １ ｇｍ。 Ｒ ｌ 卡那霉素工作浓度为５ ａ ｌ ０ ／ ０ ０ ｍ， ｇ ／
溶液 Ｉ：０２ ａＨ １ Ｓ 现用现配。 ＮＯ ， Ｄ， ［ ．Ｍ ％Ｓ
溶液Ｉ： ｌ Ｋ ， ５１ Ｍ ｃ １．ｍ 冰乙酸、２．ｍ 水，高压灭菌，４ 保存。（ ）溶菌酶溶液 Ｉ ６ｍ５ Ａ １ Ｉ ０ ８５ｌ ０ Ｃ １ ４
１ ｇｍ 溶于 ｌ Ｍ ｓ Ｃ （ ８０，新鲜配制． ｍ Ｔｉ ・ ｌ ． Ｏ ／ｌ ｍ Ｏ ｒ Ｐ ） Ｈ