香鳞毛蕨DfMYC2基因的克隆及表达分析

第３８卷第４期２０１９年㊀７月华㊀中㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l ．３８㊀N o ．４J u l y ２０１９,２７~３２收稿日期:２０１９Ｇ０１Ｇ０７基金项目:国家自然科学基金项目(３１５７０１８９)赵宗宝,硕士研究生．研究方向:植物资源学与分子生物学．E Ｇm a i l :１０９９２１３７３５＠q q．c o m 通信作者:常缨,博士,教授．研究方向:植物资源学与分子生物学．E Ｇm a i l :c h a n g y i n gn e w＠１６３．c o m 香鳞毛蕨DfMYC 2基因的克隆及表达分析赵宗宝㊀冯㊀鹏㊀张常旭㊀陈玲玲㊀李㊀杰㊀刘守银㊀常㊀缨东北农业大学生命科学学院,哈尔滨１５００３６摘要㊀基于香鳞毛蕨转录组数据克隆香鳞毛蕨MY C 类转录因子MY C ２的基因序列,获得其全长,并命名为D f M YC ２,N C B I 基因登录号为MK １９３８７１,对其蛋白序列进行生物信息学分析㊁不同部位荧光定量分析及０．４mm o l /L 茉莉酸甲酯(M e J A )处理下的表达分析.结果显示:D f M Y C ２基因全长为３１３０b p ,开放阅读框(O R F )的长度为２４９６b p ,编码８３１个氨基酸,相对分子质量为２６１０４１．８６;用０．４mm o l /L M e J A 溶液喷洒香鳞毛蕨植株叶片,在处理后０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２㊁２４㊁３６h 时取样,实时荧光定量P C R 检测结果显示,D f M YC ２在处理后４h时表达量最高.关键词㊀香鳞毛蕨;MY C ２;茉莉酸甲酯;表达分析中图分类号㊀Q９４３．２㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀１０００Ｇ２４２１(２０１９)０４Ｇ００２７Ｇ０６㊀㊀香鳞毛蕨是鳞毛蕨科(D r y o pt e r i d a c e a e )鳞毛蕨属(D r y o p t e r i s )多年生蕨类植物.将新鲜的叶片揉碎会出现特殊的香味,所以就有了香鳞毛蕨之称.香鳞毛蕨生长环境比较特殊,主要生长在纬度高且较为寒冷的地区,多处在岩石及岩缝之中.它的生长期相对较长,在－２０ħ的低温条件下依然保持活性.香鳞毛蕨在世界各地的高纬度地区呈零星分布状,生长数量相对较少.在我国主要以黑龙江省为分布中心,河北㊁吉林㊁辽宁㊁内蒙和新疆等也有少量分布[１].香鳞毛蕨在民间经常被用于治疗各种皮肤病,包括痤疮㊁皮疹㊁牛皮癣等.香鳞毛蕨富含三酚㊁黄酮㊁木脂素㊁萜㊁芳香族类等化合物,有着抗氧化㊁抑菌㊁抗银屑病和抗肿瘤等多种功效.对香鳞毛蕨药用成分的研究显示香鳞毛蕨具有很大的应用价值和开发空间.前期研究已经从香鳞毛蕨中发现并提取到了倍半萜类物质,但对于其内部的萜类代谢途径还不甚了解.植物中髓细胞组织增生蛋白(m y e l o c yt o m a Ｇt o s i s p r o t e i n s ,MY C s )即MY C 类转录因子,是植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子.MY C s 转录因子具有多种调节功能,并广泛存在于动植物中[２].茉莉酸甲酯(M e J A )是茉莉酸类激素中的一种,外源应用能够激发植物防御基因的表达,诱导植物的化学防御,产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果[３].近几年的研究表明,转录因子MY C ２对倍半萜等萜类物质的生物合成具有一定的调控作用.H o n g 等[４]发现拟南芥中M Y C ２的过表达能够增加挥发性倍半萜的含量,进一步的实验证实转录因子MY C ２正调控倍半萜合酶基因T P S １１和T P S ２１的表达;K a z a n 等[５]发现对拟南芥进行茉莉酸类和赤霉素类激素处理后,转录因子MY C ２表达量发生明显变化,从而影响萜类物质的代谢;张文娟等[６]发现茉莉酸类激素茉莉酸甲酯M e J A 外源处理能够影响大戟中h m g r ㊁s q s 与f ps 等萜类代谢关键酶基因的相对表达,进而促进三萜类物质的代谢合成;任昂[７]发现外源M e J A 处理灵芝,能够显著提高三萜类物质的含量,主要影响G l Ｇr h o 基因的表达,从而影响萜类代谢途径;李春晓[８]发现M e J A 的外源处理同样对白桦树的三萜类物质的合成具有调控作用;王焕[９]发现M e J A 能够调控阳春砂萜类化合物生物合成途径３个关键酶基因HM G R ㊁D X R ㊁D X S 的表达,影响挥发性萜类物质代谢合成.本研究以香鳞毛蕨植株转录组数据为基础,克隆得到D f M Y C ２基因,获得其全长(N C B I 基因登陆号为MK １９３８７１),并对其蛋白的氨基酸和核酸序㊀㊀华中农业大学学报第３８卷㊀列进行生物信息学分析;同时,采用M e J A 外源处理香鳞毛蕨植株,对D f M YC ２基因进行表达分析,以期为进一步研究香鳞毛蕨倍半萜合成途径及蕨类植物萜类物质代谢途径奠定基础.1㊀材料与方法1.1㊀试验材料试验材料选用笔者所在实验室人工快繁的香鳞毛蕨孢子体植株.1.2㊀试剂及引物产物纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司(中国杭州),质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自OM E G AB I O ＧT E K (美国),R a c e 试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国),R N A 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司(中国北京),R N A 反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自全式金生物技术有限公司(中国北京).载体p M D １８ＧTv e c t o r (T a K a R a ,中国大连)购自宝生物工程(大连)有限公司,大肠杆菌T r a n s １ＧT １购自全式金生物技术有限公司(中国北京).根据转录组数据利用p r i m e r５．０软件设计引物;根据D f M YC ２(G e n B a n k 登录号:MK １９３８７１)核苷酸序列设计引物.引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成(表１).表１㊀本研究所用引物T a b l e １㊀P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y编号C o d e序列S e qu e n c e (５ᶄң３ᶄ)用途U s a ge Df MY C ２Ｇ５ᶄR A C E C C C A T T T A T C A A A T C T T C G C C T A T G D f M Y C ２基因全长F u l l l e ng t ho f D f M YC ２g e n eD f MY C ２Ｇ３ᶄR A CE A A G A T G G A A T A C T C C A T G G C A TqD f MY C ２ＧF G C C T C T C C A A T C T T A G A T G G C T G C T R T ＧP C RqD f MY C ２ＧR G T T G C A A A T G A T G T G G C A A C C T A A C １８s R N A ＧF G C T T T C G C A G T A G T T C G T C T T T C 内参基因R e f e r e n c e g e n e１８s R N A ＧR T G G T C C T A T T A T G T T G G T C T T C G G1.3㊀香鳞毛蕨总RNA 提取及cDNA 合成将香鳞毛蕨植株放入液氮中研磨成粉末,按照植物总R N A 提取试剂盒说明书时进行操作.提取后用琼脂糖凝胶电泳和浓度仪检测R N A 的质量和浓度,将完整且浓度合适的R N A 置于－８０ħ冰箱中保存备用.用反转录试剂盒进行c D N A 第一链合成,按照说明书进行具体操作.反转录产物保存于－２０ħ冰箱中备用.1.4㊀香鳞毛蕨DfMYC 2基因全长的获得及氨基酸序列的生物信息学分析㊀㊀根据之前对香鳞毛蕨进行高通量测序所获得的香鳞毛蕨转录组数据库,在测序结果中选择４个候选基因片段(c o m p ２７６２９_c ０㊁c o m p３３２０３_c ０㊁c o m p ３４９８２_c ０㊁c o m p３８１０９_c ０).通过一系列的筛选及B l a s t 分析,其中c o m p２７６２９_c ０与其他植物的M Y C ２基因序列表现出很高的相似性.以c o m p ２７６２９_c ０序列为准,运用S n a pG e n e 软件设计５ᶄ和３ᶄ端引物,以香鳞毛蕨c D N A 为模板,使用R A C R 试剂盒进行５ᶄＧR A C E 和３ᶄＧR A C E 的P C R 扩增.P C R 反应体系均为:模板D N A４０n g㊁正反向引物各１p m o l ㊁T a q 酶５U ,用灭菌双蒸水补足至２０μL .P C R 反应条件均为:９４ħ预变性５m i n ;９４ħ３０s ,５６ħ３０s ,７２ħ３m i n ,３０个循环;７２ħ延伸５m i n ;最后４ħ保温.采用琼脂糖凝胶电泳将扩增产物纯化回收后,将扩增产物连接到克隆载体p E A S Y ＧT １８上,经过菌落和菌液P C R 检测后送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序,将５ᶄＧR A C E 和３ᶄＧR A C E 的测序结果与核心片段进行拼接,获得基因全长.运用E x p a s y (h t t p s ://w w w．e x p a s y ．o r g)等在线软件对MY C ２氨基酸序列进行蛋白质性质和结构的分析.1.5㊀香鳞毛蕨不同部位及MeJA 处理下不同时间段DfMYC2的表达量变化分析㊀㊀提取香鳞毛蕨叶片㊁叶柄及根的R N A 反转录成c D N A 进行D f M YC ２荧光定量分析.通过预实验筛选M e J A 的最适处理浓度,最终选用０．４mm o l /L M e J A 来处理香鳞毛蕨.将配置好的０．４mm o l /L M e J A 溶液加入到喷壶中,充分喷洒在香鳞毛蕨植株地上部分,之后用塑料袋套住整盆植株,防止M e J A 挥发导致浓度下降.在处理后０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２㊁２４㊁３６h 时取样提取R N A 并进行c D N A 合成.运用S n a pG e n e 软件设计荧光定量引物,以各个时间点提取获得的c D N A 为模板,使用荧光定量试剂盒进行实时荧光定量分析.2㊀结果与分析2.1㊀DfMYC 2基因全长的获得以c o m p ２７６２９_c ０序列作为D f M YC ２基因的８２㊀第４期赵宗宝等:香鳞毛蕨D f M YC ２基因的克隆及表达分析㊀核心片段,分别在５ᶄ和３ᶄ端设计引物,使用R A C E 试剂盒,对两端进行扩增,获得５ᶄ端和３ᶄ端序列(图１),并与核心片段进行拼接,最后得到D f ＧM Y C ２基因全长３１８３b p ,开放阅读框(O R F )的长度为２４９６b p.图１㊀D f M Y C ２基因５ᶄ端和３ᶄ端序列F i g ．１㊀S e qu e n c eo f t h e ５ᶄa n d ３ᶄo f t h e D f M Y C ２g e n e 2.2㊀DfMYC2蛋白序列的生物信息学分析１)香鳞毛蕨MY C ２蛋白一级结构的预测及分析.运用E x p a s y 在线软件(h t t p s ://w w w．e x p a s y．o r g )对D f M YC ２基因序列进行蛋白质性质和结构的分析.结果显示:转录因子MY C ２编码８３１个氨基酸残基,分子质量９１．７６８８k u ,理论等电点(pI )５．０２,分子式为C ３９７３H ６２６２O １１１２N １２９７S ４４,原子总数１２６８８.定位蛋白６７个,匹配P D B 数据库结构蛋白９个.氨基酸分布如图２所示.图２㊀香鳞毛蕨M Y C ２蛋白氨基酸分布F i g ．２㊀A m i n oa c i dd i s t r i b u t i o no f D r y o pt e r i s f r a gr a n s M Y C ２p r o t e i n ㊀㊀２)香鳞毛蕨MY C ２蛋白二级结构的预测及分析.使用在线工具(h t t p ://z h a n gl a b ．c c m b ．m e d ．u m i c h ．e d u /P S S pr e d /),对香鳞毛蕨MY C ２蛋白二级结构进行预测.结果表明,香鳞毛蕨MY C ２蛋白的二级结构中,包括αＧ螺旋(a l ph ah e l i x )㊁伸展链(e x t e n d e d s t r a n d )和无规则卷曲(r a n d o mc o i l )３种结构类型,αＧ螺旋占３８．３９％,伸展链１６．９７％,无规则卷曲３７．０６％.３)香鳞毛蕨MY C ２蛋白三级结构的预测及分析.使用E x P A S y G O R ４工具(h t t p ://s w i s s m o d Ｇe l ．e x p a s y ．o r g /),对香鳞毛蕨MY C ２蛋白三级结构进行预测,结果如图４所示,有两段螺旋型结构呈十字交叉型排列,尾部还有一个单环螺旋式结构.㊀图中红色部分为αＧ螺旋,蓝色部分为伸展链,其余未标注空白部分为无规则卷曲.I n t h e f i gu r e ,t h e r e d p a r t i s αＧh e l i x ,t h eb l u e p a r t i s e x t e n d e d s t r a n d ,a n d t h e r e m a i n i n g un m a r k e db l a n k p a r t s i s r a n d o mc o i l ．图３㊀香鳞毛蕨M Y C ２蛋白二级结构F i g ．３㊀S e c o n d a r y s t r u c t u r eo f D r y o p t e r i s f r a gr a n s M Y C ２p r o t e in 图４㊀香鳞毛蕨M Y C ２蛋白三级结构F i g ．４㊀T e r t i a r y s t r u c t u r eo f D r y o pt e r i s f r a gr a n s M Y C ２p r o t e i n ㊀㊀４)香磷毛蕨MY C ２蛋白质的信号肽预测.利用E x P A S y S i g n a l (h t t p://w w w．c b s ．d t u ．d k /s e r v Ｇi c e s /S i g n a l P )在线分析软件对香鳞毛蕨MY C ２的蛋白信号肽进行预测,对信号肽概率以及可能的裂解位点进行分析,结果表明MY C ２蛋白具有信号肽,且信号肽的酶切位点位于第２２和第２３号氨基酸之间,属于分泌性蛋白.５)香鳞毛蕨MY C ２蛋白卷曲螺旋预测分析.釆用E M B N E T (h t t p ://w w w．c h ．e m b n e t ．o r g/)的C O I L S 程序对香鳞毛蕨MY C ２蛋白卷曲螺旋进行预测.结果发现,D f MY C ２蛋白质中卷曲螺旋存在９２㊀㊀华中农业大学学报第３８卷㊀的可能小于５％,没有显著性.因此,可以认为没有卷曲螺旋结构的存在.６)香鳞毛蕨MY C ２蛋白跨膜区分析.通过E x P A S y 的在线跨膜区结构预测软件TMHMM ２．０(h t t p://w w w．c b s ．d t u ．d k /s e r v i c e s /T MHMM /)对香鳞毛蕨MY C ２蛋白进行跨膜区分析,图６结果显示香鳞毛蕨MY C ２蛋白不存在跨膜区.７)香鳞毛蕨MY C ２蛋白遗传进化分析.对获得的香鳞毛蕨M Y C ２基因的氨基酸序列进行推测,与其他公开发表的植物M Y C ２氨基酸序列进行比对,通过M E G A ６．０软件构建遗传进化树.通过比对发现,香鳞毛蕨D f M Y C ２氨基酸序列与番茄(S o l a n u ml y c o p e r s i c u m )物种关系较为接近(图７).㊀图中的S 值代表信号肽可能出现的区域,C 值代表未经优化的裂解位点,Y 值是综合了S 值和C 值所得出的优化裂解位点.此外还有S 平均值和D Ｇs c o r e (d i s c r i m i n a t i o ns c o r e )值:前者是从氨基酸N 端到剪切位点处各氨基酸S 值的平均值,D Ｇs c o r e 是S 和Y 平均值的加权平均值.T h e S v a l u e i nt h ef ig u r e r e p r e s e n t sth er e gi o n w h e r et h es i g n a l p e p t i d e m a y a p Ｇp e a r ,t h e C v a l u er e p r e s e n t s t h eu n o p t i m i z e dc l e a v a g es i t e ,a n d t h e Y v a l u e i s t h e o p t i m i z e d c l e a v a g e s i t e o b t a i n e db y c o m b i n i n g t h e S v a l u e a n d t h e C v a l u e ．T h e r e a r e a l s o v a l u e s o fm e a n S a n d D Ｇs c o r e (d i s c r i m i n a t i o n s c o r e ):t h e f o r m e r i s t h e a v e r a g e o f t h e S v a l u e s o f t h e a m i n o a c i d s f r o mt h eN Ｇt e r m i n u s t o t h e c l e a v a ge s i t e ,a n d D Ｇs c o r e i s t h ew e i g h t e da v e r a g eof t h em e a n S a n d Y v a l u e s ．图５㊀香鳞毛蕨M Y C ２蛋白信号肽预测F i g ．５㊀S i g n a l P ＧH M M p r e d i c t i o no f D r y o pt e r i s f r a gr a n s M Y C ２p r o t e i n 2.3㊀香鳞毛蕨不同部位DfMYC 2的表达量变化提取香鳞毛蕨叶片㊁叶柄及根的R N A 反转录成c D N A 进行D f M YC ２荧光定量分析.结果如图８所示,D f M Y C ２在叶片中含量最高,叶柄次之,根部最低.图６㊀香鳞毛蕨M Y C ２蛋白跨膜结构分析结果F i g ．６㊀A n a l ys i s r e s u l t o f t h e t r a n s m e n b r a n ec o n s a t r u c t i o n o f D r y o p t e r i s f r a gr a n s M Y C ２p r o t e i n 2.4㊀MeJA 处理下DfMYC 2的表达量变化实时荧光定量P C R 检测D f M YC ２基因在０．４mm o l /L M e J A 处理下不同时间的表达情况(图９),结果显示,该基因在M e J A 处理４h 时表达量最高,６h 下降,８h 又升高,之后逐渐趋于平缓.3㊀讨㊀论香鳞毛蕨作为一种民间广泛流传的药用资源植物,探究其活性成分的代谢途径,能够为其药用分析及开发利用提供强有力的理论依据[１０Ｇ１１].萜类是普遍存在于植物界的一类化合物,在动物界为数甚少.除以萜烃的形式存在外,还存在各种含氧衍生物,包括醇㊁醛㊁酮㊁羧酸㊁酯类以及甙的形式.其次,还有含氮的衍生物㊁少数含硫的衍生物存在.萜类化合物在植物体内的生命活动中具有重要的作用,如调控赤霉素㊁脱落酸㊁茉莉酸等重要激素的代谢途径,类胡萝卜素和叶绿素是重要的光合色素,质体醌和泛醌为光合链和呼吸链中重要的电子递体,甾醇是生物膜的组成成分等[１２].笔者所在课题组之前的研究数据表明,香鳞毛蕨中的萜类化合物含量丰富,其中的倍半萜含量较高并已经成功从香鳞毛蕨中提取.目前关于蕨类植物的萜类代谢途径还没有统一的定论,对于蕨类植物的萜类代谢途径研究还不够深入.为了进一步探究蕨类植物的萜类代谢途径,我们选择通过研究香鳞毛蕨倍半萜的代谢来探索蕨类植物的萜类代谢途径.对香鳞毛蕨进行高通量测序,得到香鳞毛蕨转录组数据库.通过对转录组数据的分析,选择在拟南芥等植物中与萜类代谢尤其是倍半萜代谢密切相关的MY C ２转录因子,通过R A C E 技术获得其全长,并对其氨基酸序列进行了生物信息学分析.M Y C s 转录因子在植物中广泛分布并具有多种调节功能,对植物的生长发育起到至关重要的作用[１３].０３㊀第４期赵宗宝等:香鳞毛蕨D f M YC ２基因的克隆及表达分析㊀图７㊀香鳞毛蕨和其他植物的M Y C ２氨基酸序列的遗传进化分析F i g ．７㊀P h y l o g e n e t i c t r e e i l l u s t r a t i n g t h e g e n e t i c r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nM Y C ２f r o m D ．f r a gr a n s a n do t h e r p l a n ts 图８㊀不同部位M Y C ２基因的表达量差异F i g ．８㊀D i f f e r e n c e i ne x pr e s s i o no f M Y C ２g e n e i nd i f f e r e n t pa r ts 图９㊀M e J A 处理下不同时间D f M Y C ２基因的表达量变化F i g ．９㊀C h a n g e s i ne x pr e s s i o no f D f M Y C ２g e n e u n d e r d i f f e r e n t t i m eo fM e J A t r e a t m e n t研究表明,MY C 类转录因子是植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子.尤其是MY C ２能够直接影响植物中萜类物质的代谢,与植物的防御体系密切相关[１４Ｇ１５].MY C ２转录因子通过形成C O I １/J A Z s /MY C ２复合物发挥调控作用,参与J A ㊁A B A 等激素信号转导过程[１６Ｇ１７].M e J A 作为茉莉酸类激素中的一种,外源应用能够以模拟机械损伤和昆虫侵袭方式来影响植物体内萜类物质的积累[１８].通过对香鳞毛蕨不同部位D f MY C ２的荧光定量分析,发现其在叶片中表达量最高,表明MY C ２转录因子发生部位主要在叶片.并且多年的研究发现,M e J A 与萜类物质代谢也有着十分密切的关系.为了进一步验证M e J A ㊁MY C ２转录因子与萜类代谢三者之间的关系,我们选用M e J A 对香鳞毛蕨进行外源处理来观察MY C ２的表达量变化,研究结果从侧面验证了D f MY C ２与香鳞毛蕨的萜类代谢途径的确存在着联系,为进一步研究蕨类植物的萜类代谢奠定基础.参考文献[１]㊀常缨．香鳞毛蕨国内外研究进展[J ]．北方园艺,２００９(４):１１３Ｇ１１５．[２]㊀沈乾,陆续,张凌,等．植物中MY C ２转录因子功能研究进展[J ]．上海交通大学学报(农业科学版),２０１２,３０(６):５１Ｇ５７．[３]㊀桂连友,刘树生,陈宗懋．外源茉莉酸和茉莉酸甲酯诱导植物抗虫作用及其机理[J ]．昆虫学报,２００４,４７(４):５０７Ｇ５１４．[４]㊀HO N G GJ ,X U EXY ,MA OYB ,e t a l ．A r a b i d o ps i s MY C ２i n Ｇt e r a c t sw i t hD E L L A p r o t e i n s i nr e g u l a t i n g s e s q u i t e r p e n es y n Ｇt h a s e g e n e e x p r e s s i o n [J ]．P l a n t c e l l ,２０１２,２４(６):２６３５Ｇ２６４８．[５]㊀K A Z A N K ,MA N N E R SJ M．MY C ２:t h em a s t e r i na c t i o n [J ]．M o l e c u l a r p l a n t ,２０１３,６(３):６８６Ｇ７０３．[６]㊀张文娟,曹小迎,蒋继宏．茉莉酸甲酯诱导大戟三萜类代谢的研究[J ]．广西植物,２０１５(４):５９１Ｇ５９７．[７]㊀任昂．茉莉酸甲酯对灵芝三萜生物合成的影响及其灵芝应答基因的差异表达研究[D ]．南京:南京农业大学,２０１２．[８]㊀李春晓．M e J A 和S A 对白桦幼树三萜合成调控及F P S 基因克１３㊀㊀华中农业大学学报第３８卷㊀隆[D]．哈尔滨:东北林业大学,２０１２．[９]㊀王焕．M e J A影响阳春砂挥发性萜类和转录组变化的研究[D]．广州:广州中医药大学,２０１５．[１０]L I J,C H E N K,WA N GF,e t a l．M e t h y l j a s m o n a t e l e a d s t on e cＧr o s i s a n d a p o p t o s i s i nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a c e l l s v i a i n h i b iＧt i o no f g l y c o l y s i s a n d r e p r e s s e s t u m o r g r o w t h i n m i c e[J]．O nＧc o t a r g e t,２０１７,８(２８):４５９６５Ｇ４５９８０．[１１]P E N GZ,Z H A N GY．M e t h y l j a s m o n a t e i n d u c e s t h e a p o p t o s i s o fh u m a nc o l o r e c t a l c a n c e r c e l l s v i ad o w n r e g u l a t i o no fE Z H２e xＧp r e s s i o nb y m i c r o R N AＧ１０１[J]．M o l e c u l a r m e d i c i n er e p o r t s,２０１７,１５(２):９５７Ｇ９６２．[１２]L I U Y,L U O S H,S C HM I D T A,e ta l．A g e r a n y l f a r n e s y ld i p h o s p h a te s y n t h a s e p o v i d e s t h e p r e c u r s o rf o r s e s t e r t e r p e n o i d(C２５)f o r m a t i o n i n t h e g l a n d u l a r t r i c h o m e so f L e u c o s c e p t r u m c a n u m[J]．P l a n t c e l l,２０１６,２８(３):８０４Ｇ８２２．[１３]H E D H I L IS,D E MA T T E I M V,C O U D E R T Y,e ta l．T h r e e n o nＧa u t o n o m o u s s i g n a l s c o l l a b o r a t e f o r n u c l e a r t a r g e t i n g o f C rＧMY C２,a C a t h a r a n t h u s r o s e u s b H L Ht r a n s c r i p t i o nf a c t o r[J]．B M Cr e s e a r c hn o t e s,２０１０,３(１):１Ｇ９．[１４]WO L D E MA R I AM M G,D I N H S T,O H Y,e ta l．N a MY C２t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e g u l a t e s a s u b s e t o f p l a n t d e f e n s e r e s p o nＧs e s i n N i c o t i a n aa t t e n u a t a[J]．B M C p l a n tb i o l o g y,２０１３,１３(１):７３[２０１９Ｇ０１Ｇ０７]．h t t p:w w w．b i o m e d c e n t r a l．c o m/１４７１Ｇ２２２９/１３．７３．[１５]C U IH T,Q I UJD,Z H O U Y,e t a l．A n t a g o n i s m o f t r a n s c r i pＧt i o n f a c t o rMY C２b y E D S１/P A D４c o m p l e x e s b o l s t e r s s a l i c y l i ca c i dd e f e n s ei n A r ab i d o p s i s e f f ec t o rＧt r i g g e r e di mm u n i t y[J]．M o l e c u l a r p l a n t,２０１８,１１(８):１０５３Ｇ１０６６．[１６]A L F I E R IM,V A C C A R O M C,C A P P E T T A E,e t a l．C o a c t i v aＧt i o no f M E PＧb i o s y n t h e t i c g e n e sa n da c c u m u l a t i o no fa b i e t a n ed i te r p e n e si n S a l v i as c l a r e a b y h e t e r o l o g o u se x p r e s s i o n o fWR K Ya n d MY C２t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s[J/O L]．S c i e n t i f i cr eＧp o r t s,２０１８,８(１):１１００９[２０１９Ｇ０１Ｇ０７]．h t t p s://d o i．o r g/１０．１０３８/s４１５９８Ｇ０１８Ｇ２９３８９Ｇ４．[１７]Z H A N G M,J I N X,C H E N Y,e ta l．T c MY C２a,ab a s i ch e l i xＧl o o pＧh e l i x t r a n s c r i p t i o nf a c t o r,t r a n s d u c e s j aＧs i g n a l sa n dr e g uＧl a t e s t a x o l b i o s y n t h e s i s i n T a x u s c h i n e n s i s[J/O L]．F r o n t i e r s i n p l a n t s c i e n c e,２０１８,９:８６３[２０１９Ｇ０１Ｇ０７]．h t t p s://w w w．n c b i．n l m．n i h．g o v/p m c/a r t i c l e s/P M C６０２１５４０/p d f/f p l sＧ０９Ｇ００８６３．p d f d o i:１０．３３８９/f p l s．２０１８．００８６３．[１８]A D E B E S I N A,A D E O L UWA O A,E D U V I E R E A T,e ta l．M e t h y l j a s m o n a t e a t t e n u a t e dl i p o p o l y s a c c h a r i d eＧi n d u c e d d eＧp r e s s i v eＧl i k eb e h a v i o u r i n m i c e[J]．J o u r n a lo f p s y c h i a t r i cr eＧs e a r c h,２０１７,９４:２９Ｇ３５．C l o n i n g a n d e x p r e s s i o no fD f M Y C２g e n e f r o m D r y o p t e r i s f r a g r a n sZ H A OZ o n g b a o㊀F E N GP e n g㊀Z H A N GC h a n g x uC H E N L i n g l i n g㊀L I J i e㊀L I US h o u y i n㊀C H A N G Y i n gC o l l e g e o f L i f eS c i e n c e s,N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,H a r b i n１５００３６,C h i n aA b s t r a c t㊀B a s e do nt h et r a n s c r i p t o m ed a t ao f D r y o p t e r i s f r a g r a n s,t h e g e n es e q u e n c eo f MY C２t r a n s c r i p t i o nf a c t o r MY C２w a s c l o n e d a n d n a m e d a s D f MY C２．T h e g e n e a c c e s s i o n n u m b e r w a s MK１９３８７１．B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f t h e p r o t e i n s e q u e n c e,f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f d i f f e r e n t p a r t s a n de x p r e s s i o na n a l y s i so f０．４mm o l/L m e t h y l j a s m o n a t e(M e J A)w e r e p e r f o r m e d．T h er e s u l t s s h o w e d t h a t t h eD f MY C２g e n ew a s３１３０b p i n f u l l l e n g t h a n d t h e o p e n r e a d i n g f r a m e(O R F)w a s２４９６b p i n l e n g t h,e n c o d i n g８３１a m i n oa c i d sw i t har e l a t i v e m o l e c u l a rw e i g h to f２６１０４１．８６．T h e l e a v e so f D．f r a g r a n s w e r e s p r a y e dw i t h０．４mm o l/L M e J As o l u t i o n,a n d s a m p l e sw e r e t a k e n a t０h,２h,４h,６h,８h,１２h,２４h a n d３６h a f t e r t r e a t m e n t．T h e r e s u l t s o f r e a lＧt i m e q u a n t i t a t i v ePC Rs h o w e d t h a tD f M Y C２h a d t h eh i g h e s t e x p r e s s i o na t４ha f t e r t r e a t m e n t．I tw i l l p r o v i d e t h e f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r s t u d y i n g t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o no fD f MY C２g e n e i n D．f r a g r a n s．K e y w o r d s㊀D r y o p t e r i s f r a g r a n s;MY C２;M e J A;e x p r e s s i o na n a l y s i s(责任编辑:张志钰)２３。