AnnexinV凋亡试剂盒操作步骤
AnnexinV-FITC细胞凋亡检测说明书
凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（FITC、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
与FITC 的绿色荧光信号相比，FITC的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用FITC作为荧光标记探针。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份三、操作步骤1．用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；2．用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~5×105细胞；3．吸取250μL的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；4．用上述500μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；5．加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；6．避光室温反应5min；根据不同的分析方法选择步骤A或B。
A．荧光显微镜观察1．滴一滴经过步骤1~6处理过的细胞悬浮液于载玻片，并用盖玻片盖上细胞；2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1）将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2）用PBS洗涤细胞两次；（3）吸取250μL 的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；（4）加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；（5）将（4）步骤的溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（6）避光室温反应5 min。
凋亡、周期操作步骤
凋亡操作步骤Annexin V-FITC／PI法检测细胞凋亡1.将细胞收集到离心管中，1000rpm离心10min，除去上清，用4℃预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心10min，再重复一次，最后除去上清；2.在冰浴上，加入500μl的上样缓冲液到离心管中，用吸管吹打使细胞重悬，然后转移到1.5ml EP管中；3.先加入5μl AnnexinV-FITC，振荡均匀后4℃避光孵育15min，然后再加入5μlPI，同样孵育5min；4.孵育后立即上流式细胞仪分析。
注意：●需制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a.没有染色的细胞；b.经过处理，仅用AnnexinV-FITC染色的细胞；c.经过处理，仅用PI染色的细胞。
●理想样品浓度调至105-106 cells/ml，一般实验只需0.5 ml的样品。
周期操作步骤1.细胞培养●药物作用后，将细胞胰酶消化，轻轻吹打下细胞至15ml离心管。
●1000 rpm×5 min离心，弃上清。
2.细胞固定●加入3ml 预冷PBS重悬细胞，1000 rpm×5 min离心，弃上清。
●加入500ul PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，在V ertex上低速涡旋震荡（1档），逐滴加入到1.5 ml 100%乙醇（4℃），使其终浓度为75% ，4℃放置过夜固定。
（注意：这里是细胞悬液逐滴加入到100%乙醇中）3.细胞标记●取出固定的样品，1000 rpm×5 min离心，弃上清。
●加入3 ml预冷PBS重悬细胞，1000 rpm×5 min离心，弃上清，收细胞。
●加入150 μl RNaseA（250 μg/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。
●加入150 μl PI（100 μg/ml ,PBS溶解），4℃避光染色30分钟。
●转至流式检测管，分析细胞DNA含量的变化及细胞周期。
AnnexinV-APC和7-AAD双染色检测细胞凋亡
AnnexinV-APC和7-AAD双染色检测细胞凋亡
细胞功能实验—Annexin V-APC/7-AAD双染色检测细胞凋亡
1. 材料
1.1. 实验材料
所用基础培养基请根据所培养细胞需求确定。
1.2. 试剂配制
1.2.1 培养基配制
于基础培养基中，加入10%FBS，1%双抗，以及其他营养成分（个别细胞需要额外的营养因子，请参考细胞需求），轻轻混匀，4℃冰箱储存（以下简称培养基）。
1.2.2 75%乙醇配制
取75ml无水乙醇，加入25ml超纯水，混匀。
1.2.3 PI染液配制（根据试剂盒说明书配制）
1.3. 主要仪器
1
2. 实验步骤（根据试剂盒说明书操作）
1.用不含EDTA 的胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm，3min 离心，吸去上清，用PBS
洗1遍，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。
2.取1E+5 个细胞量的悬液，离心弃上清，加入500 μl Binding buffer 重悬细胞。
3.加入5 μL Annexin V-APC，混匀后，再加入5 μL 7-AAD染液，混匀，室温，避光，反应
5-15 min后置于冰上。
4.1小时内进行流式细胞仪机检测。
5.GFP的绿色荧光：FITC通道筛选GFP阳性细胞进行Annexin V-APC／7-AAD荧光检测。
6.Annexin V-APC的红色荧光：激发波长633nm，最大发射波长660 nm。
7.7-AAD红色荧光：激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm。
2。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明1. 对于悬浮细胞：a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。
注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
c. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
d. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
e. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。
可以使用铝箔进行避光。
孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。
初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。
如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。
注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
2. 对于贴壁细胞的消化后检测：a. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。
室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。
需避免胰酶的过度消化。
中文操作手册 细胞凋亡
凋亡检测操作流程一、Annexin V检测凋亡细胞膜的改变试剂及溶液：A．对于单独购买的试剂：a)10X Binding Buffer （货号：556454）：0.1 M HEPES，pH 7.4；1.4 M NaCl；25 mM CaCl 2。
使用前稀释至1X。
b)Propidium Iodide（PI，货号：556463）：建议与以下试剂同时使用 Annexin V-FITC（货号： 556420,556419）或 Annexin V-Biotin （货号： 556418，556417）c)Via-Probe™ （货号：555816 ）：核酸染料7-AAD。
建议与以下试剂同时使用Annexin V-PE（货号：556422，556421）或Annexin V-Biotin（货号：556418，556417）。
d)1X PBS Buffer （货号： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4• 7H20, 0.24 g KH2PO4 , 加水至1L。
调整pH值至 7.2。
高压灭菌室温保存。
B．对于凋亡检测试剂盒（货号：556547）a)FITC Annexin V （组分编号： 51-65874X）：每个样本5 μl用量。
b)Propidium Iodide （PI，组分编号： 51-66211E)）：现成的核酸染料。
每个样本5 μl用量。
c)10X Annexin V Binding Buffer（组分编号： 51-66121E）： 0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl,25 mM CaCl2.使用时用双蒸水配制成1X。
操作步骤：1．取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2．使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1⨯ Binding Buffer缓冲液制成1⨯106细胞/ml的悬液。
3．Falcon试管中加入100 µl细胞悬液。
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒操作方法及步骤说明书
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。
以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。
注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。
操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
PH0536 Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒操作手册
PH0536|Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-PE apoptosis detection kit）货号：PH0536规格：PH0536-20|20T存储：4℃保存，半年有效。
AnnexinV-PE需避光保存。
◆产品组分试剂组成规格保存Annexin V-PE100uL4℃Annexin V-PE结合液12mL4℃，避光说明书1份/◆产品简介Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit)是用PE(Phycoerythrin)标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。
可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。
本试剂盒检测的是红色荧光，因此在待检测的细胞已经表达GFP等绿色荧光蛋白的情况下，特别适合使用本试剂盒检测细胞凋亡。
PE可以被495nm、545或564nm的激发光所激发，发出峰值为575nm的荧光。
(参考图1)Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。
但仅Annexin V被报道可以调控一些PKC的活性。
Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。
磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。
在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。
磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。
而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。
用带有红色荧光的荧光探针PE标记的Annexin V，即Annexin V-PE，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
正常细胞不会被Annexin V-PE所染色，凋亡细胞和坏死细胞都会被Annexin V-PE所染色。
kga101 n凯基annexin vegfp细胞凋亡检测试剂盒说明书
凯基Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit）Cat number：KGA For Research Use OnlyStore at4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。
二、 试剂盒组份组份Cat: KGA10110 assays Cat: KGA10220 assaysCat: KGA10350 assaysCat: KGA104100 assays储存条件AnnexinV-EGFP 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光Propidium Iodide 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 50 mL 4℃三、 试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液四、 使用注意事项1．微量试剂取用前请离心集液。
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Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)
产品名称货号规格储存条件运输条件
Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温
PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温
10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温
*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算
产品描述
细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。
例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。
然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。
细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。
目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。
Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。
在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。
所需的设备和材料
-合适量程的移液枪-样品和诱导剂
-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水
-流式细胞仪或荧光显微镜。
*最大激发/发射波长Annexin V,FITC:494 nm/518 nm; PI:535 nm/617 nm
溶液制备
1×Annexin V Binding solution
-将10×Annexin V Binding Buffer用蒸馏水稀释10倍。
稳定性
试剂盒在0-5°下可以保存6个月，请避光保存Annexin V,FITC结合物。
操作流程
Ⅰ.悬浮细胞的操作流程
（Ⅰ）诱导凋亡的操作步骤
1.制备细胞（Jurkat cell）悬液（1×106 cells/ml）
2.加入终浓度为1 μg/ml的凋亡诱导剂（Staurosuporine）
3.在37℃下培养3.5 h。
* Staurosuporine用于诱导Jurkat cell凋亡。
最佳诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。
（Ⅱ）Annexin V染色操作步骤
1.将细胞悬液转移到离心管中，1,000 rpm离心3 min，取出上清液。
2.加入PBS，1,000 rpm离心3 min，去除上清液。
再重复本步操作一次。
3.用之前准备好的1×Annexin V Binding Solution制备细胞终浓度为1×106 cells/ml的细胞悬液。
* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 μl细胞悬液。
4.取100 μl步骤3中制备的细胞悬液，加入到一个新的tube中。
5.向细胞悬液中加入5 μl Annexin V,FITC结合物，再加入5 μl PI Solution。
6.室温下避光培养15 min。
7.加入400 μl 1×Annexin V Binding Solution，请在在1小时内检测。
Ⅱ. 贴壁细胞的操作流程
（Ⅰ）诱导凋亡的操作步骤
1.制备细胞（Caco-2）悬液（1×106 cells/ml）
将细胞悬液接种到培养皿或者培养板中。
2.在5% CO2培养箱中37℃预培养。
3.加入终浓度为25 μmol/ml的凋亡诱导剂（Cisplatin）
4.37℃培养4 days。
*Cisplatin用于诱导Caco-2 cell凋亡。
最佳的诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。
（Ⅱ）Annexin V染色操作步骤
1.弃去培养皿或培养板中的上清液。
2.用PBS洗细胞2次。
3.用胰蛋白酶消化细胞。
4.用适量的培养基或PBS将细胞悬液转移至离心管中。
5.1,000 rpm离心3 min，弃上清。
6.加入PBS后1,000 rpm离心3 min，弃上清。
重复本步操作一遍。
7.加入预先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成终浓度为1×106 cells/ml的细胞悬液。
* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 μl细胞悬液。
8.取100 μl步骤7中的细胞悬液，加入到新的tube中。
9.向细胞悬液中加入5 μl Annexin V,FITC结合物，再加入5 μl的PI Solution。
10.室温下避光培养15 min。
11.加入400 μl 1×Annexin V Binding Solution，请在1小时内检测。
Ⅲ. 设定的对照
1.未染色细胞。
2. Annexin V-FITC染色细胞（没有PI）。
3.PI染色细胞（没有Annexin V-FITC）。
Ⅳ. 流式细胞仪检测
加样到流式细胞仪检测，激发波长E x=488 nm; 发射波长E m=530 nm。
Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI的红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测（建议使用FL3）。
Ⅴ. 荧光显微镜检测
将细胞悬液滴到玻片上，置于显微镜上使用合适的滤光片检测。
*由于EDTA会对细胞膜的特定部位有损伤，建议使用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。
注意事项
1.PI有潜在的致癌性，操作时请特别注意并采取必要的防护措施。
2.Annexin V,FITC和PI均对光敏感。
所有染色过程和培养过程均需避光。
3.若细胞收集过程中使用胰酶，需设法去除残留的胰酶，这些胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。
实验实例
a.staurosporine诱导凋亡的图像
b.对照组（无staurosporine处理）
图1. staurosporine诱导Jurkat细胞凋亡的图像
a.参照（无Staurosporine处理）
b. Staurosporine诱导的凋亡
图2. Staurosporine诱导凋亡后的活细胞数量（FITC/PI 二维点阵图；细胞：Jurkat）
a.参照（无paclitaxel处理）
b.Paclitaxel诱导的凋亡。
图3.paclitaxel诱导凋亡后的活细胞数量（FITC/PI 二维点阵图；细胞：MDA-MB-231）图2、3中诱导凋亡组(b)显示早期细胞凋亡区域(Q4)比无凋亡组该区域(a)的细胞数量更多。
处于凋亡晚期的细胞数量也可以被观察到(Q2)，几乎所有细胞的凋亡情况都可以观测到。