Annexin V-FITC PI细胞凋亡检测试剂盒
Annexin V-FITC说明书
注意事项：
¾ 如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。 ¾ 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。 ¾ 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染
色失败。 ¾ 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。 ¾ 需自备PBS。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用本产品的文献：
1. Wu XX, Sun Y, Zhou XB, Zhang J, Yu BY, Xu Q. Effect of Bufotalin on the Apoptosis of BGC-823 Cells. Chinese medicine and clinical pharmacology of new drugs.2007 March,Vol.18 No.2.
包装清单：
产品编号 C1062-1 C1062-2 C1062-3
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产品名称
Annexin V-FITC Annexin V-FITC结合液
Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
2. Yang L, Zhou X, Yang J, Yin X, Han L, Zhao D. Aspirin inhibits cytotoxicity of prion peptide PrP106-126 to neuronal cells associated with microglia activation in vitro. J Neuroimmunol. 2008 Aug 13;199(1-2):10-7.
分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。 2. 对于贴壁细胞：
A. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。 室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
使用说明：
1. 对于悬浮细胞： A. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm)离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。 注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
B. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 C. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 D. 室温(20-25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。 E. 1000g离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 F. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。 G. 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显微镜下检测，1000g离心5
Annexin V凋亡试剂盒操作步骤
请在使用前仔细阅读说明书Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)产品名称货号规格储存条件运输条件Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算产品描述细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。
例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。
然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。
细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。
目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。
Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。
在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。
所需的设备和材料-合适量程的移液枪-样品和诱导剂-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水-流式细胞仪或荧光显微镜。
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒操作方法及步骤说明书
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。
以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。
注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。
操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
ANNEXIN V-FITC PI 凋亡检测试剂盒说明书
第1页，共3页ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。
货号：CA1020规格：20T/50T /100T保存：2-8°C ，避光保存，有效期1年。
产品说明：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。
PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。
Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS 。
PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
操作步骤:1.细胞样品的准备：a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。
用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到离心管内。
1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约1ml 4℃预冷的PBS ，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
kga101 n凯基annexin vegfp细胞凋亡检测试剂盒说明书
凯基Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit）Cat number：KGA For Research Use OnlyStore at4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。
二、 试剂盒组份组份Cat: KGA10110 assays Cat: KGA10220 assaysCat: KGA10350 assaysCat: KGA104100 assays储存条件AnnexinV-EGFP 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光Propidium Iodide 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 50 mL 4℃三、 试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液四、 使用注意事项1．微量试剂取用前请离心集液。
Annexin V-FITCPI细胞凋亡检测试剂盒
Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒上海优宁维生物科技有限公司一、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。
AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
图Annexin V 检测细胞凋亡原理三、实验步骤贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。
注意过度消化可损伤细胞。
在消化时可加2％的BSA 可防止消化过度。
如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。
（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；（2）细胞收集。
悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。
(AnnexinV-FITC) PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况
（Annexin V－FITC）/ PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况：原理：细胞膜组分磷脂酰丝氨酸（PS）在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。
磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。
荧光素FITC 标记的Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，指示坏死或凋亡的细胞。
FITC-Annexin V结合到细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光。
碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染，而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞则不会有红色荧光产生。
联合应用Annexin V-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，Annexin V(-)/PI(-)代表健康活细胞，Annexin V(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，Annexin V(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，后两者之和即为受损细胞总量。
步骤：1．如上法构建杀伤体系靶细胞0.5ml、效细胞0.5ml，分别加入24孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中分别孵育3h、6h、12h；2. 把杀伤体系中的细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞）；3. PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度；4. 加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g 离心5min，弃上清，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于1×105），然后1000g离心5min，收集细胞；5. 加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞；6. 加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min；7. 加入10μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min；8. 在30min内进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
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Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit
一、试剂盒说明
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。
二、试剂盒组份 组份
(20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC
100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide
100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20
℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。
3、Store at -20℃ for 12 months
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液
四、使用注意事项
1.
微量试剂取用前请离心集液。
2.
Annexin V-FITC ，Propidium Iodide （PI ）避光保存及使用。
对于Annexin V-FITC 这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。
3.
Propidium Iodide （PI ）有毒，操作时要戴手套。
4.
本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。
5. 推荐使用悬浮培养细胞。
如果是贴壁细胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而
用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。
可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。
6.
细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每
次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
五、 操作方法
1. 悬浮细胞离心（2000rpm 离心5min ）收集；贴壁细胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不
易过长，否则容易引起假阳性）；
-20℃避光 4℃避光 4℃
2.
用PBS 洗涤细胞二次（2000rpm 离心5min ）收集1~5×105细胞； 3.
加入500μL 的Binding Buffer 悬浮细胞； 4.
加入5μL Annexin V -FITC 混匀后，加入5 μL Pr opidium Iodide ，混匀； 5.
室温、避光、反应5～15min ； 6.
请在1 hour 内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
A ．荧光显微镜观察
1)
滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞； 2) 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
① 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
② 用PBS 洗涤细胞两次；
③ 在500μL 的Binding Buffer 中加入5μL Annexin V -FITC ，5 μL Propidium Iodide ，混匀；
④ 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；
⑤ 避光、室温反应5 min 。
⑥ 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC 和罗丹明）观察。
Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。
B ．流式细胞仪分析
1)
用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm 。
2)
Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光（流式Ex=488nm,Em ≥630nm ）通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。
3)
荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
六、 实验范例
用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37o C ，5%CO 2培养箱培养4～6h 后，参照说明书的操作方法进行检测，经流式细胞仪检测结果见下图。
对照 诱导剂处理。