植物组织培养植物器官以及组织培养
植物组织培养
1.植物组织培养（离体培养）：是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育形成完整植物体的过程。
2、植物组织培养的类型（1）根据培养基的类型分为:固体培养液体培养半液半固体培养（2）根据培养材料（外植体类型）分为：植株培养器官培养组织培养原生质体培养胚胎培养细胞培养（3）按培养过程分：初代培养继代培养生根培养3、植物组织培养的一般工作流程1.准备阶段：（1）查阅资料，制定培养方案；（2）清洗组培用器皿、工具；（3）配制所需试剂和培养基；（4）试剂、培养基及器皿、工具的灭菌。
2.外植体的选择与消毒；3.初代培养；4.继代培养；5.生根培养；6.炼苗移栽4、植物细胞的全能性概念：指植物体的每个活细胞都携带有该物种的全套遗传信息，在适宜条件下，离体细胞都具有发育为一个完整植株的潜在能力。
注意：（1）活细胞（2）离体细胞（3）细胞全能性表达的难易程度取决于细胞的分化程度5、细胞全能性的强弱表现：（1）植物细胞全能性根据细胞的性质不同由强到弱：营养生长中心＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化细胞）＞特化细胞（导管等）（2）植物细胞全能性根据所处的组织不同由强到弱：顶端分生组织＞侧生分生组织＞居间分生组织＞薄壁组织＞厚角组织＞输导组织＞厚壁组织6、植物组织培养中全能性表达的条件：1.无菌条件；2.离体条件；3.一定的营养物质；4.植物生长调节物质；5.适宜的外界条件。
7、胚性细胞的特点：未分化状态；细胞具有旺盛分裂能力；具有两极性8、脱分化：指在一定条件下，已分化成熟的细胞、组织或器官恢复到未分化的分生状态，并进行细胞分裂形成未分化的细胞团，如愈伤组织的形成过程。
9、愈伤组织形成的三个时期：（1）诱导期又称启动期（最难）。
（2）分裂期（3）分化期10、优良愈伤组织的特征：（1）具有旺盛的增殖能力；（2）容易散碎；（3）具有高度的胚性或再分化能力，便于植株再生；（4）经过长期的继代保存而不丧失胚性。
植物组织培养
植物组织培养的含义：将植物的离体材料（器官、组织、细胞、原生质体等）无菌培养，使其生长、分化、繁殖，再生出完整植株或生产次生代谢物质的技术。
植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性：指一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。
外植体：在植物组织培养中，在活体植物上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。
外植体选择的原则：①、再生能力强；②、遗传稳定性好；③、来源丰富；④、灭菌容易。
植物组织培养的类型：根据培养材料（即外植体）的不同，可将植物组织培养划分为植株、胚胎、器官、组织、细胞和原生质体五个水平上的培养类型。
愈伤组织：原指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
植物组织培养的特点：①、培养材料经济；②、培养条件可以人为控制；③、生长周期短，繁殖率高；④、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。
White（1943）撰写的《植物组织培养》是第一部有关植物组织培养的专著。
PH值最适5.6，高温、高压灭菌后PH值会降低，配制时一般为5.7~5.8，若PH值偏高，培养基会偏硬，会不利于植物材料吸取营养；PH值偏低，培养基凝固不好，不利于植物材料的固定。
MS培养基特点：①、无机盐成分很高，硝酸盐、NH+、K+含量高；②、元素平衡较好；③、缓冲性能也比较好；④、微量元素、有机成分丰富、齐全。
无机盐母液适度冷藏保存。
维生素等有机营养元素在—20℃保存，使用前用温水溶解。
MS培养基母液的成分：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。
CuSO4、CuCl2取25mg溶于10mL，制成2.5mg/mL溶液，配制50mL微量元素母液，吸取该溶液0.05mL。
灭菌的条件：培养基的成分：1、水分2、无机盐①、大量元素：指植物生长发育所需浓度大于0.5mmol/L的营养元素。
植物的器官和组织培养
二、植物根段培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外 植体进行离体培养，再生完整植株的过程 。是研究根系生理代谢、器官分化及形态 建成的良好实验体系。培养方法与叶片培 养相似。
培养过程包括愈伤组织诱导、不定芽分 化、无菌苗的增殖与生根等。
大蒜根尖培养及植株再生
三、植物茎段培养
植物茎段培养是指对植物的带有定芽或 不定芽的外植体进行离体培养，再生完 整植株的过程。
利用灭菌剂对 外植体灭菌
无菌水冲洗 3-5次
1、茎尖、茎段、叶片的灭菌 2、根、块茎、鳞茎的灭菌 3、花蕾的灭菌 4、果实、种子的灭菌
二、初代培养物的建立
（一）无菌环境 （二）规范操作 （三）条件合适
三、形态发生和植株再生
外植体 愈伤组织
体胚途径
植株
具根茎的两极器官
器官化途径
先茎后根
单极器官
先根后茎
对培养的要求：成熟种子萌发培养所用培养基成 分简单，不需生长调节剂；未成熟种子萌发培养 则需要添加一定的营养成分和生长调节剂。若需 要其形成愈伤组织，需要相应的生长调节剂及营 养物质。
第四节 植物组织培养和脱毒苗的生产
一、植物分生组织(meristem culture)培养：
定义：是指对植物的分生组织进行离体培养 的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组 织和形成层组织的培养。其中茎尖培养广泛 应用于植物再生和脱病毒研究。
植物茎尖培养过程
➢茎尖离体培养可能出现的培养反应：
生长太慢 生长过旺，愈伤增多 生长正常
三、利用茎尖培养生产脱毒苗
脱毒苗生产的意义 茎尖脱毒机理 基本技术规程 影响脱毒效果的因素
1、脱毒苗生产的意义：
目前受病毒危害严重影响生产的有：
植物组织培养笔记111
第一章绪论植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。
植物组织培养类型:1、完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较小植株等的培养。
2、胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
3、器官培养（Organ Culture）包括离体根、茎、叶、果实、种子、花等器官的培养。
4、组织培养（Tissue Culture）如分生组织、薄壁组织、输导组织、愈伤组织培养。
5、细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
6、原生质体培养（Protoplast Culture）指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
组培的一般过程：初代培养—继代培养—生根培养—驯化培养植株的再生途径：1）器官发生途径（Organogenesis）：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程2）体细胞胚胎发生途径（Somatic embryogenesis）: 体胚发生途径是指二倍体或单倍体的细胞在特定条件下，未经性细胞融合而产生与合子胚结构、功能类似的胚的过程。
经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somatic embryo). 组培的应用：1、优质种苗的快速无性繁殖：1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快繁2）通过茎尖培养生产脱毒种苗2、用于植物遗传育种：种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培养产生三倍体；离体授粉克服远缘杂交不亲和性；胚培养拯救杂种胚；原生质体培养进行体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛选；用于植物基因转移操作等3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。
植物组织培养技术的应用
植物组织培养技术的应用
植物组织培养技术是一种利用植物细胞、组织和器官进行人工培养的技术。
它具有广泛的应用，包括以下几个方面：
1. 繁殖和育种：通过组织培养技术，可以实现无菌条件下的无限繁殖植物，从而达到育种的目的。
此外，还可以利用组织培养技术进行杂交、突变和基因工程等技术，以实现更准确、更高效的育种。
2. 生产药物和化学品：植物组织培养技术可以用于生产药品和化学品。
例如，可利用植物细胞和组织生产抗癌药物、抗生素、香料和色素等物质。
3. 植物保育：植物组织培养技术可以用于保护濒危植物和珍稀植物。
通过无菌的组织培养技术，可以繁殖珍稀植物，以避免其在自然界中灭绝。
4. 研究和教育：植物组织培养技术可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的基础知识。
此外，还可以作为教育工具，帮助学生更好地了解植物的生长过程。
总之，植物组织培养技术在农业、医药、环境和教育等领域都有着广泛的应用。
植物器官和组织培养的基本程序
植物器官和组织培养的基本程序离体的植物器官和组织在人工培养条件下，通过不同的器官发生途径，形成体细胞胚或茎芽，进一步再生成完整植株。
因此，植物器官和组织培养的基本程序包括：无菌外植体的获得、初代培养物的建立、形态发生、植株再生以及培养产物的观察记载。
一、无菌外植体的获得从自然界和室内采集的植物器官和组织材料携带有各种微生物，这些污染源一旦进入培养容器中，造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。
所以，污染是组织培养的一大障碍。
利用各种灭菌剂可以进行外植体的灭菌，但不同植物或同一植物不同器官和组织的带菌程度不同，所用灭菌剂的种类、浓度及灭菌方法也不尽相同。
(一)茎尖、茎段、叶片的灭菌灭菌前外植体用清水冲洗，茸毛较多的外植体用皂液洗涤后再用清水冲洗、用吸水纸吸干表面水分；将外植体浸泡在0.1%～0.2%的氯化汞溶液中2～10min，或先在70%～75%酒精中浸数秒，然后在10%次氯酸钙溶液中浸泡10～20min。
或先在70%～75%酒精中浸泡数秒，再在2%次氯酸钠溶液中浸泡15～30min进行灭菌；灭菌后倒掉灭菌液，无菌水冲洗外植体3～5次，置外植体于无菌滤纸上吸干表面水分，适当分割后接种。
(二)根、块茎、鳞茎的灭菌这类材料生长在土中，灭菌较困难，且挖取时易受损伤。
所以灭菌前应仔细清洗，对凹凸不平及鳞片缝隙处，需用软刷清洗，并切除损伤部位。
灭菌时应增加灭菌时间或增大灭菌剂浓度，如将外植体浸泡在0.1%～0.2%氯化汞溶液中5～12min，或在70%～75%酒精中浸数秒，然后用6%～10%次氯酸钠溶液浸5～20min进行灭菌。
灭菌后的操作步骤同上。
(三)花蕾的灭菌未开放花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，所以采摘后可直接灭菌。
灭菌时先在70%～75%酒精中浸蘸10～30s，然后在0.1%氯化汞溶液中浸泡3～10min或在1%次氯酸钠溶液中浸泡10～20min。
灭菌后的处理同上。
(四)果实、种子的灭菌这类材料有的表皮具有茸毛或蜡质。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
植物组织培养技术
初代培养（ culture） 初代培养（primary culture）：指在组织 培养过程中，最初建立的外植体无菌培 养阶段。由于首批外植体来源复杂，携 带较多细菌，要对培养条件进行适应， 因此，初代培养一般比较困难。 继代培养（ subculture） 继代培养 （ subculture ） ： 在组织培养过 程中，当外植体被接种一段时间后，将 已经形成愈伤组织或已经分化根、茎、 叶、花等的培养物重新切割，转接到其 它培养基上以进一步扩大培养的过程称 为继代培养。
另一为药物和生物制品的工业生产，探索 天然药物生产工业化的途径是当前药物生产 的一个新方向，有可能用组织培养法来代替 全植物提取有效成分。组织培养应用在药学 方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速， 它具有如下一些优点： 1．利用组织培养代替原植物的栽培以获得 所需的有效成分，达到产量高，成本低的目 的，还可节约土地。 2．除了应用于产生次生物质外，还可应用 于生物转化。例如烟草组织培养中蒂巴因去 甲基后可能生成吗啡。
目前中国已成功地将麦角菌、灵芝、猴 头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织 培养在工业化中的应用也正在研究。 总之，植物组织培养这一新技术在中草药 方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利 于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生 物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化 生产问题得到解决，将可以为防病治病做出 很大的贡献。
2 培养基的种类 MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基等等。 3 培养基的配制 （1）混和培养基中的各成分 （2）融化琼脂 （3）调整pH为5.8 （4）分装 （5）灭菌 （6）放置备用
二组织培养操作的一般流程
1 2 3 4 5 6 器皿的洗涤 培养基的配制和灭菌 接种室及用具消毒 材料灭菌：70％酒精、氯化汞 接种 无菌培养
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（5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降
低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗 生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽
选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移 栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗 完全成活后，再移向大田。
（四）果实和种子的灭菌
表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温-80。 果实70%酒精浸泡数秒—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min， （或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭菌水冲洗3-5次—无 菌滤纸吸干—分割—接种。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
初代培养物的建立
（一）无菌环境
培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗 生素物质（去除侵入组织内部的病菌。见表）
器官发生 体细胞胚胎发生
植物组织培养植物器官以及组织培 养
形态发生和植株再生
器官发生：芽或芽原基起源于培养组织中比较表 层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即 内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。
胚状体发生：极大多数体细胞胚起源于单细胞， 形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在 方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母 体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维 管组织呈独立的Y形。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
拟定培养方案
外植体预处理
外植体无菌接 种
启动培养
分化出芽、胚 状体或原球茎
继代增殖培养
生根培养
炼苗移栽
成活供生产使 用
培养基配制灭菌
植物组织培养的一般程序
植物组织培养植物器官以及组织培 养
第一节 植物器官和组织培养的基本程序
无菌外植体的获得 初代培养物的建立 形态发生和植株再生 培养产物的观察记载
组织的干重或鲜重 （二）胚状体 胚状体诱导率=产生胚状体的外植体数/外植体总数
×100% （三）芽 芽分化数=产生芽的外植体数/外植体总数×100% （四）根 发根率=发根芽数/培养芽数 每个材料平均发根数植物组织培养植物器官以及组织培
养
第二节 植物营养器官培养
植物根段培养 植物茎段培养 植物叶培养
所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。 （2）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进
行消毒处理。 将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，
或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
（3）启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使
植物组织培养植物器官以及组织培 养
一、离体根的培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外植体进行培 养的技术。
（一）根无性系的建立 来自无菌种子发芽产生的幼根切段或植物根系经灭 菌处理后的切段，可以以两种方式进行培养，建立根的 无性繁殖系。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
一、离体根的培养
1、根的直接增殖 1）根无性繁殖系的建立
第三章 植物器官和组织培养
植物器官和组织培养的基本程序 植物营养器官培养 植物繁殖器官培养 植物组织培养
植物组织培养植物器官以及组织培 养
组织培养步骤图
植，根据已成功培养的相近植物资料，结合
实际制定出切实可行的培养方案。 根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段
（二）规范操作
操作技术熟练、工作经验、操作者、进入超净工作台 的物品表面。
（三）条件合适
培养基种类、激素种类和浓度、其他添加物、外植 体来源、生长发育状态、培养条件。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
形态发生和植株再生
建立的无菌培养物在适宜的离体环境 中，生长发育（形态发生）形成完整的 小植株。
离体材料的形态发生的途径：
将种子进行表面消毒，在无菌条件下进行无菌萌 发，待根伸长后从根尖一段切取长1.0cm的根尖，接种 培养基中。
这些根的培养生长很快，番茄根每天约生长10mm， 几天后发育出侧根。待侧根生长约一周后，即可切取 侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长出侧根， 又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖 衍生而来的离体根的无性系。
外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋 芽直接萌发形成芽。
将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基 或形成胚状体，最后发育形成再生植株。 （4）增殖培养
分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培 养基经反复多次切割转接。
当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根， 另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病 毒检测。
诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 （三）外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养
植物组织培养植物器官以及组织培 养
植物组织培养植物器官以及组织培 养
培养产物的观察与记载
（一）愈伤组织 诱导率=产生愈伤组织的外植体数/外植体总数×100% 生长量=培养一段时间后愈伤组织干重或鲜重-接种时愈伤
生长在土中，灭菌困难，以受损伤。 灭菌前仔细清洗，加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
无菌外植体的获得
（三）花蕾的灭菌
未开放的花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态， 采摘后可直接灭菌。 70%酒精浸泡10-30s—0.1-0.2%氯 化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭 菌水冲洗3-5次—无菌滤纸吸干—分割—接种。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
外植体形态发生形成完整植株的途径
（一）外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种：
1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。 2、愈伤组织-茎-根-植株。 3、愈伤组织-根-芽-植株。 4、愈伤组织-体细胞胚-植株
植物组织培养植物器官以及组织培 养
（二）外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生： 1、器官上发生。 2、愈伤组织上发生。 3、游离单细胞发生。 4、小孢子发生。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
无菌外植体的获得
（一）茎尖、茎段、叶片的灭菌
清水冲洗，吸干—0.1-0.2%氯化汞浸泡2-10min， （70%酒精浸泡数秒，10%次氯酸钙浸泡10-20min或2% 次氯酸钠浸泡15-30min）—灭菌水冲洗3-5次—无菌滤 纸吸干—分割—接种。
（二）根、块茎、鳞茎的灭菌