分析色谱与制备色谱的关系
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
色谱法知识简介
色谱法知识简介一、色谱法的定义色谱法（色谱分析、为色层法、层析法），是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。
二、色谱法的特点及优缺点（1）特点：具高超的分离能力，其分离效率远远高于其他分离技术，如蒸馏、萃取、离心等方法。
（2）优点：①分离效率高；②应用范围广；③分板速度快；④样品用量少；⑤灵敏度高；⑥分离和测定一次完成；⑦易于自动化，可在工业流程中使用。
（3）缺点：对所分析对象的鉴别功能较差，一般来说色谱的定性分析是靠保留值定性，但在一定的色谱条件下，一个保留值可能对应许多个化合物。
（为分离和鉴定一个有机混合物，常常把色谱方法的高效分离能力和光谱方法的鉴别能力结合在一起，发展了各种各样的联用技术。
）三、色谱法的分类1、按分离原理分——吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法、亲和色谱法等。
2、按分离方法分——纸色谱法、薄层色谱法（TLC）、柱色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等。
3、按两相状态分类——气相色谱（气－固、气－液）、液相色谱（液－固、液－液）、超临界流体色谱、化学键合相色谱等。
4、按实际应用方面分——分析型色谱、制备型色谱。
定义：在一定温度下，处于平衡状态时，溶质在互不相溶的两相间浓度之比。
mC C K s S C ：每1ml 固定相中含有溶质的质量；（国标中以C L 表示） m C ：每1ml 流动相中溶解溶质的质量。
分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
分配系数对系统中组分的影响：在同一色谱条件下，样品中K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。
由此可见，组分在两相中的分配系数越大，越易分离。
K 对色谱峰的影响：正常峰——条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定样品浓度很低时（S C 、m C 很小）时K 只取决于组分的性质，与浓度无关。
制备型液相色谱的分类及特点
制备型液相色谱的分类及特点色谱已有100余年的历史，它一开始就是为制备性分离而产生的，其目的在于分离制备一种或多种纯组分。
从20世纪初发展至今，色谱技术已由分析规模发展到制备和生产规模，在药物研究尤其是活性成分的分离纯化中发挥着越来越重要的作用。
制备色谱并非分析色谱的简单放大，而是按一定纯度要求，分离、富集或纯化一定量的目标产物进行后续研究，需要考虑目标产物的产率、纯度等。
本文就制备型液相色谱的特点进行阐述。
液相色谱即为将填料填装入色谱柱内，以液体流动相对样品进行洗脱。
利用不同样品的不同性质与填料的相互作用进行分离。
在制备液相色谱分离中，一般将柱压力低于0.5MPa的称为低压制备色谱，压力为0.5~2MPa的称为中压制备色谱，压力>2MPa的称为高压制备色谱[1]。
◎中压制备液相色谱◎高压制备液相色谱低压制备色谱一般为两种模式：一是在色谱柱上方加压，另一种是在色谱柱下方减压。
除此之外，其他模式与经典色谱法基本一致。
其中减压通常使用真空泵来完成，加压一般使用空气泵、氮气钢瓶、蠕动泵等来完成。
在低压制备色谱中使用的填料通常是大颗粒的填料。
故其分辨率有限[2]。
中压制备色谱是利用恒流泵输送流动相，携载样品流过色谱柱，从而对样品进行分离。
中压制备色谱系统由溶剂瓶、恒流泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站和馏分收集器等部分组成。
其色谱柱常为耐高压的强化玻璃柱，填料颗粒大小比低压制备色谱所用的填料粒径更小，从而获得更高的分离效率。
高压液相色谱是利用粒径更小的高效填料进行分离，因其小粒径所带来的高流速高柱效与简短的分离时间。
所以高压制备液相色谱又被称为高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC ），与经典液相色谱有着很大的不同[3]下图为不同制备型色谱的对比：低压、中压、高压制备对比虽然制备型液相色谱也有着需要大量溶剂、产品过于稀释以及无法避免的使用有毒的有机溶剂等缺点[4,5]，但制备型液相色谱同样具有分离模式多样、压力恒定，重现性好等优点，所以在生产各个领域内应用相当广泛[6]。
制备色谱原理
制备色谱原理色谱是一种在化学分析中常用的技术，用于将混合物中的化合物分离和纯化。
其原理基于不同化合物在固定相和移动相之间的相互作用差异。
色谱通常由两个主要组成部分组成：固定相和移动相。
固定相是一种固定在色谱柱或色谱板上的物质，其表面具有特定的化学性质。
移动相是一种液体或气体，它将样品分子通过固定相进行传递。
在液相色谱中，固定相通常是一种多孔性固体，如硅胶或交联聚合物。
移动相是一种液体，也称为流动相。
当样品溶解在流动相中时，它们会与固定相的表面相互作用。
不同化合物与固定相的相互作用力量不同，因此它们在色谱柱中的通过速度也不同。
气相色谱中，固定相是一种吸附剂或液滴，通常涂在色谱柱内壁上。
移动相是一种惰性气体，如氮气或氦气。
样品气体在固定相的表面上发生吸附，不同化合物的吸附速度也不同。
通过调整移动相的组成，色谱可以实现不同化合物的分离。
移动相的选择依赖于样品的性质以及所需的分离效果。
一些常用的移动相包括纯溶剂、溶液和稀释的溶液。
此外，还可以通过调节流量速度、温度和色谱柱的长度和直径来优化分离效果。
色谱分离过程中，化合物的相对移动速度被称为保留因子（Retention factor，简称Rf）。
它可以通过计算化合物的保留时间与移动相的保留时间比值得到。
保留时间是化合物从进样口到检测器所需的时间。
最后，通过检测器对色谱分离后的化合物进行检测和分析。
常用的检测器包括紫外可见光谱仪、质谱仪、荧光检测器和红外光谱仪等。
这些检测器可以通过检测化合物的光学、电化学或质谱性质来确定其结构和浓度。
通过色谱技术，可以将混合物中的化合物进行有效分离和纯化，并为进一步的分析提供准确的样品。
这种分离方法在各种领域中得到广泛应用，包括医药、食品、环境和石油化工等。
制备液相色谱技术(LC-MS)
64
2021/5/27
65
2021/5/27
66
2021/5/27
67
结束
2021/5/27
68
... ...
重复性
选择性要求
色谱柱吸附等温线
正常载荷(loading)：
色谱柱吸附等温线
超载(overloading)：
纯度（purity)、产量（throughput） 和收益（yield）（PTY）三者的关系
浓度过载和体积过载
2021/5/27
15
浓度过载和体积过载色谱示意图
什么时候使用浓度过载?
影响到馏分的纯度； 参数设置方便； 需配备MS检测器，设备费用投入较大。
2021/5/27
35
Mass-based
当使用按质量进行馏分收集时，只有当 MSD检测到色谱峰含有目标质量数，且该目 标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收 集才被触发。这就确保了在每次进样中只收 集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有 一个馏分。
1. 基于时间（Time-based） 2. 基于峰（peak-based） 3. 基于质量（Mass-based）
基于时间（Time-based）
根据馏分的保留时间及其色谱峰宽， 以时间作为馏分收集器动作的指令参数。
特点：
参数设置方便，样品收益高、损失少。
色谱保留时间的不稳定会影响到馏分 的纯度和收益。
高效制备液相色谱技术
高效制备液相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的 ，那就是色谱理论。
但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。 分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。 制备型色谱：要求纯度、产量和收益。
瓦里安系列10-瓦里安制备色谱系统概述
泵耐压范围（Prostar 218)
最高达8700 psi 200 mL/min 泵头 3500 psi 100 mL/min 泵头 4000 psi
ProStar 210/218制备系统配置
Prostar 210/218泵系统（泵头5-200ml/min可选） Prostar 325 紫外可见检测器 多功能阀箱（分析/制备切换阀） 7725i和3725手动进样器 701组分收集器 Star 工作站 预装柱或小型装柱机
制备色谱中的重要问题
产品的纯度 处理量
(每单位时间所纯化的样品量) 回收率 生产时间 方法开发与放大
纯化成本
制备色谱分离参数之间的关系
上样量 色谱柱规格 填料性质 样品性质
分离度
速度
上样量
制备色谱方法开发
分析HPLC
传统的开发方法
传统制备色谱
颗粒 长度 柱直径 流速 操作时间 消耗溶剂
制备色谱技术
制备色谱的目的是收集更多的 被纯化的产品，而不是用于分 析化合物的组分含量，产量从 几毫克到几公斤
制备色谱技术是得到高纯物的 最好的分离方法之一
制备色谱规模划分
mg-g级
小量制备， 色谱柱直径10-50mm
g-100g级 中试规模制备 色谱柱直径41-150mm
生产规模制备 色谱柱直径100-600mm
色谱柱柱效是影响分离效果相当关键的因素
粒径 (um)
孔径 (A)
填料粒径越小，柱效越高 系统反压将随填料粒径的降低而增加 使用小颗粒填料及更高压力操作是制备发展的趋势
填料粒径与柱效
小粒径 vs 大粒径填料
41mm制备柱、理论塔板数10000、等度分离，进样 20次
第八章层析
层 析分 类
2. 固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸层析法、薄层层析法和柱层析法
纸层析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于大量制备分离，是主要的层析
分离手段。
层 析分 类
3. 压力
在以固体为固定相的液相柱层析中，根据操作压力的不同，分为低压(压力一般小于0.5MPa)、中
2.阻滞因数Rf ：
基本概念
Rf 流溶动质相的的迁迁移移速＝ 速率 同率一溶 时质 间的 流迁 动移 相距 的 距离 迁 离移
溶质的迁移距离＝ V
＝V
能进行分配的有效 积截A面m＋kd As
流动相的迁移距AV离 m ＝Rf
Am Am＋kd
As
基本概念
3.洗脱体积VR ：溶质达最大浓度时，已流出的流动相体积， VR＝Vm＋kdVs 滞留时间：溶质流出色谱柱所需的时间 tR＝VR/Qe t0＝Vm/Qe Qe:洗脱剂的流量 t0：死时间
C B A A+B
层 析分 类
5.分离操作方式 :顶替展开 又称置换，排代展开，利用一种与固定相作用力极强的置换剂作流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分
子。优点是浓缩，单位柱长固定相的利用率最高。但各组分一个连一个的流出，界线不明，分离不理想 ；合适的置换剂不易找到。
D
A
B
D：置换剂
层 析分 类
压(压力为0.5～4.OMPa)和高压(压力为 4.0～40MPa)液相层析法；
高压液相层析法中层析介质(固定相)微细，分离精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制备
分离常用低压或中压液相层析法。
层 析分 类
4.流动相的流动方向 轴向流层析； 径向流层析：溶质在半径方向上得到分离
HPLC分析型与制备型的区别
1. HPLC分析型与制备型的区别两个的用途完全不一样，分析型是用来做样品定性，纯度检测的，制备型是用来快速分离和纯化产品的。
主要是分析型的样品通量很小，而制备型的通量是分析型的几百倍上千倍，为了达到这个效果，制备型选用的是大流速的泵（几十毫升每分钟甚至上百毫升没分钟），粗粒径填料，粗管径的色谱柱，以提高柱子的载样量，同时牺牲的是分离效率，制备型一次可以制备毫克级的样品，甚至大型的专用制备仪器可以制备克级的样品2.高效液相色谱的优点和常见问题高效液相色谱（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法；⑵速度快，十几分钟到几十分钟可完成；⑶重复性高；⑷高效相色谱柱可反复使用；⑸自动化操作，分析精确度高。
根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液－固色谱、液－液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。
高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂类等。
高效液相色谱的常见问题有：1、涡流扩散（Eddy diffusion）流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。
如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。
因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
2、分子扩散（Molecular diffusion）分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。
要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。
同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
3、质量转移（Mass transfer）被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分析色谱与制备色谱的关系
色谱是一种分离和检测化学物质的技术。
它包括两种主要类型：分析色谱和制备色谱。
分析色谱是将混合物中的化合物分离出来并用于定量或定性分析。
制备色谱则是分离和纯化化合物，以便进一步研究和应用。
分析色谱
分析色谱主要用于分离和分析化合物的混合物。
它可以通过分离成分并测量它们的浓度来帮助确定样品中有哪些化合物以及各个化合物的相对量。
常见的分析色谱技术包括气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC）。
在分析色谱中，样品与载体分子之间发生相互作用。
在气相色谱中，样品与气体相互作用，而在液相色谱中，样品与液体相互作用。
这些相互作用包括吸附、色谱、分区等等。
分析色谱具有高度选择性和精确性，因此在化学、环境、生物和制药等领域广泛应用。
制备色谱
制备色谱主要用于生产和纯化化合物。
它可以将混合物中的化合物分离出来，并且能够将目标化合物的产量分离和纯化以生产纯净的化合物。
常见的制备色谱技术包括闪蒸色谱、反渗透色谱和离子交换色谱。
制备色谱通常需要承受更高的负载量和更大的样品体积。
制备色谱的颗粒尺寸也比较大，通常在10-50微米之间，这样可以保持较高的通量和良好的压力降。
制备色谱通常用于生产中的分离和纯化，它在化学工业、制药工业和制备生物制品方面应用广泛。
分析色谱与制备色谱的关系
分析色谱和制备色谱之间有很大的相似之处。
它们都基于相互作用原理在载体物质上对样品进行分离。
分析色谱和制备色谱中使用的技术，例如液相色谱，闪蒸色谱和离子交换色谱，正是它们之间的共同之处。
两种技术中使用的色谱柱也相似。
柱中通常填充有可以和样品分子进行相互作用的载体物质。
不同的是，分析色谱柱的颗粒大小较小，为3-10微米，而制备色谱柱的颗粒大小则较大，通常在10-50微米之间。
这是因为制备色谱柱需要承受更高的负载量。
在某些情况下，分析色谱和制备色谱可以互相协作，以优化分离和纯化过程。
例如，分析色谱可用于确定需要纯化的目标化合物。
之后，制备色谱可用于大批量分离和纯化目标分子。
总之，分析色谱和制备色谱是化学和制药领域中非常重要的技术。
它们提供了高效和准确的化合物分离和纯化方法。
尽管分析色谱和制备色谱之间存在一些不同之处，但两者之间也存在很多共同之处。
了解这两种技术及其关系可以帮助我们更好地应用它们。