细菌形态学检查法(一)
临床微生物学检验技术
2．葡萄糖代谢类型鉴别试验 (O-F试验）
原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参 加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解 葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环 境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能 分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson， HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
（2）用毛细滴管将菌液滴于洁净的玻片上，缓慢倾斜玻 片任菌液流开，始之成为均匀薄膜，将玻片置37℃温箱内， 任其自然干燥，切勿用火焰固定。
（3）在干燥标本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆盖于 薄膜上，作用1～2min后轻轻用水冲，干后镜检观察。
3.结果 菌体染成红色（或深紫色），鞭毛染成淡红色（或
方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵 育18~24h，观察结果。
结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。
应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法 对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳 性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼 亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙 门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。
结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性
应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。 本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳 性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。
6．胆汁七叶苷水解试验
原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。 七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的 二价铁离子发生反应形成黑色化合物。
三、生化反应
酶系统 对底物的分解能力 代谢产物
微生物免疫学实验报告
1实验内容：2显微镜油镜的使用与保护。
3细菌的形态与结构的观察。
4实验目的：5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。
6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。
7熟悉细菌的特殊结构。
8实验材料：显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。
4实验方法：(1)显微镜油镜的使用与保护显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的工具。
因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。
1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。
2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。
对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。
3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。
⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。
⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。
4、显微镜的保护：⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。
⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。
避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。
⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。
置于干燥处，以防受潮。
(二)细菌形态观察1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌2、细菌的特殊结构：荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌鞭毛：水弧菌（周毛菌）一、实验内容：3细菌标本片的制备（操作）4革兰染色法（操作）二、实验目的：1进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查是指通过观察细菌的形态、结构和大小来进
行分类和鉴定的方法。
常用的方法包括：
1. 显微镜观察，使用光学显微镜或电子显微镜观察细菌的形态
和结构。
通过放大细菌的形态特征，如形状、大小、细胞壁结构等
来进行分类和鉴定。
2. 染色法，常用的染色方法包括革兰氏染色、折射率染色、吉
姆萨染色等，这些染色方法可以使细菌在显微镜下更清晰地显示出
形态特征，有助于鉴定。
3. 形态培养特性，利用不同的培养基和培养条件，观察细菌在
不同环境下的生长特性和形态变化，如菌落形态、生长速度等。
4. 生化反应，通过观察细菌对不同生化试剂的反应，如碘试验、氧化酶试验等，来鉴定细菌的形态学特征。
5. 分子生物学方法，包括PCR、序列分析等技术，通过对细菌
的基因组进行分析，可以更准确地鉴定细菌的形态学特征。
综上所述，细菌的形态学检查常用的方法包括显微镜观察、染色法、形态培养特性、生化反应和分子生物学方法，这些方法可以从不同角度全面地观察和鉴定细菌的形态学特征。
细菌形态学检查法(一)
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------细菌形态学检查法(一)细菌形态学检查法(一) 细菌形态学检查法（一）细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。
临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。
一、显微镜细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。
细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。
1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长 0.4～0.7m，最大分辨率 0．2m，约为波长的一半。
人肉眼能分辨的最小距离是 0．2mm，因此用油镜放大 1000 倍，0．2m 的微粒即被放大到肉眼可见的 0．2mm。
一般细菌都大于 0．m，故可用普通光学显微镜进行观察。
2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。
观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效1 / 3果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。
3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在 365～435nm 之间。
根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。
因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。
细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。
用于观察细菌的结构及鉴别细菌。
细菌形态学检查法
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
3.其他染色方法（1）源自毛染色 （2）荚膜染色细菌形态学检查法
重点提示
• 不染色标本的形态学检查 • 染色标本的形态学检查
– 革兰染色 – 抗酸染色
一、显微镜
1.普通光学显微镜（light microscope）
– 光源：可见光
2. 暗视野显微镜（ dark field microscope ）
– 暗背景，菌体发光 –用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运
1.革兰染色（Gram staining） （1）原理
– 细胞壁学说：两种细菌细胞壁结构不同-G+菌肽 聚糖层厚、致密，脂质含量少；G-菌薄而疏松， 脂质含量多。
– 等电点学说： G+菌pI 2～3； G-菌pI 4～5 – 化学学说： G+菌含有核糖核酸镁盐多， G-菌
含量少。
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
（2）结果
– 细菌分为革兰阳性（G+）菌和革兰阴性（G-）菌
紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌
革 兰 染 色 方 法
三、细菌染色标本的检查
2.抗酸染色
（1）原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要 成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石 炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用， 因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到初步鉴别细 菌的目的。
复红、刚果红等。
3.中性染料：碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞
氏染料、姬姆萨染料等。
三、细菌染色标本的检查
(二)常用染色方法 • 单染色法
– 只用一种染料，如吕氏美蓝。用于观察细菌的 形态、大小、排列。
细菌的形态学检查
目 录 末页
革兰染色法
结晶紫、碳酸钠初染，30秒 碘液媒染30秒
丙酮酒精数滴，脱色约5秒
碱性复红液2~3滴，5秒钟
待干，镜检。
注：每一步均需 细流水冲洗。
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• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
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• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
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革兰氏染色意义：
注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
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细菌形态示意图绘图要求
绘细菌的
形态 排列 染色性 特殊结构
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1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
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（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀 死细菌。
玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆 样速度通过三次，时间约3秒钟。
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革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（碘液）
脱色（95%乙醇） 复染（复红）
• 玻璃折射率： n=1.52
• 香柏油折射率： n=1.515
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二、细菌标本染色检查法
临床微生物学及检验
一 碳水化合物的代谢试验 二 二 蛋白质和氨基酸的代谢试验
ห้องสมุดไป่ตู้三 碳源和氮源利用试验 四 酶类试验
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一、碳水化合物的代谢试验
类别 生化试验
原理
培养基/试剂 阳性结果
应用
碳 糖(醇)发酵试 各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类 含糖、醇、 溴甲酚紫变黄 肠杆菌科细菌的鉴
水
验
的酶，分解糖类的能力不同，产酸、产
实验1 细菌形态学检查
【实验目的】
1.掌握普通光学显微镜的原理和使用方法。 2.掌握悬滴法、压滴法及结果判读 。 3.熟悉细菌染色基本原理；掌握革兰染色法、
抗酸染色法。
2
【实验器材】 1.菌种 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、
变形杆菌、耻垢分枝杆菌。 2.培养基 普通琼脂平板、肉汤培养基、罗
氏培养基。 3.试剂 无菌生理盐水、凡士林、结晶紫、
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4. 半固体穿刺接种法：由培养基中央刺到距管底约半厘米处，然后
沿穿刺线退出接种针。
用途：检验细菌的运动性或观察细菌的生化反应。
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四、细菌的培养方法
1. 需氧培养法：将已接种的表皮葡萄 球菌的琼脂平板、斜面或液体培养 基置35℃培养箱培养18-24h，观察细 菌生长情况。
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2. 二氧化碳培养法（烛缸法）：取有磨口 标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处涂 以凡士林，将接种细菌的培养基放入缸 中，点燃缸内蜡烛，加盖密封，当蜡烛 燃烧时会消耗缸内氧气并产生CO2，浓度 约为5%左右，将烛缸置35℃培养箱。
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三、细菌的接种与分离技术
细菌接种的基本程序： ➢ 灭菌接种环（杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本） ➢ 沾取标本 ➢ 接种 ➢ 灭菌接种环（杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境）
细菌标本形态学检验
细菌标本形态学检验形态学检查方法是细菌检验中极为重要的鉴定手段之一，它不仅有助于细菌的初步识别，同时也是决定进行生化反应鉴定的重要步骤。
如痰中的抗酸杆菌、脑脊液中脑膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。
通过形态学检查得到初步的诊断。
由于细菌体积小，无色透明，因此利用光学显微镜直接检查只能观察到细菌的动力，对形态、大小、排列方式、染色特性及特殊结构的判定，还须借助于染色标本的观察。
要研究其细菌的超微结构，还需用电子显微镜。
一、不染色标本检查法不染色标本的检查用于观察活菌状态，常用以检查细菌的动力或运动状况。
1．湿片法：用接种环取细菌培养液两环，置于载玻片中央，轻轻覆以盖玻片。
菌液要适量，不可外溢，不可有气泡。
高倍镜下观察。
2．悬滴法：加一小滴菌液在盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少量凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，盖在凹玻片上，迅速翻转玻片，用小镊子轻压，使盖玻片与凹玻片粘紧，密封凹窝边缘。
高倍镜下观察。
3．毛细管法：本法适用于观察厌氧菌动力。
先将待检菌接种在适宜的液体培养基中，经厌氧过夜培养后，以毛细管（长60～70nm ，管径0．5 ～1．0nm ）接触培养物，使菌液进入毛细管中，用火焰封闭毛细管两端，将毛细管固定在载玻片上，镜检。
二、染色标本检查法（一）基本方法细菌胞浆无色透明，不易识别。
常用适宜的染料使细菌着色后，以观察其形态和特殊构造，且可按染色反应进行分类。
1．原理（1）物理吸附作用：由于毛细管现象和渗透作用，使染料进入细胞内被溶解吸收。
此外，细菌等电点较低，pH值2 ～5，在一般情况下细菌带负电荷，易和带正电荷的碱性染料相结合。
（2）化学反应：菌体内某些化合物和染料相结合，发生化学反应使细菌着色，而且不易被脱色剂所脱色。
（3）其他因素：细胞膜的通透性、膜孔的大小、细胞结构完整与否以及培养基成分，染色液中电解质含量、pH值、菌龄等都是影响细菌着色的因素。
2．方法（1）涂片：临床标本大多可直接涂抹在洁净的载玻片上。
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细菌形态学检查法（一）
细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。
临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。
一、显微镜
细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。
细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。
1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长0.4～0.7μm，最大分辨率0．2μm，约为波长的一半。
人肉眼能分辨的最小距离是0．2mm，因此用油镜放大1000倍，0．2μm的微粒即被放大到肉眼可见的0．2mm。
一般细菌都大于0．μm，故可用普通光学显微镜进行观察。
2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。
观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。
3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在365～435nm之间。
根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。
因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。
细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。
用于观察细菌的结构及鉴别细菌。
4．相差显微镜相差显微镜是利用相差板的光栅作用，在普通光学显微镜基础上配制特殊相差板，采用特殊相差目镜制成。
当光线透过标本时，标本不同部位因密度不同，引起光位相差异，相差板的光栅作用改变直射光的光位相和振幅，把光位相差异转为光强度差异，从而显示细菌不同部位的差异。
多用于不染色活细菌的形态、内部结构及运动方式的观察。
5．电子显微镜电子显微镜以电子流代替光源，其波长与可见光相差几万倍，因而分辨能力得到极大提高，能分辨1am的微粒。
目前使用的电子显微镜有透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)两类。
TEM可用于观察细菌、病毒的超微结构；SEM主要适合对细菌、病毒等表面结构及附件和三维立体图像的观察。
电子显微镜观察须经特殊制片，无法观察活体微生物，因而在微生物学检验中不常使用。
二、不染色标本的检查
不染色标本一般用于观察细菌的动力及运动情况，但不能清楚地看到细菌的形态及结构特征。
有动力的细菌在镜下呈活泼有方向性的运动，有明显位移；无动力的细菌则在原位颤动，呈不规则的布朗运动。
常用的方法有压滴法和悬滴法，以普通光学显微镜观察，如用暗视野显微镜，效果更好。
在临床上，有时通过不染色标本的动力检查可对某些病原菌作出初步鉴定。
如疑似霍乱患者，可取其米泔水样便，制成压滴或悬滴标本，高倍镜或暗视野下观察细菌动力，若见穿梭样运动的细菌，则同法再制备一标本片并加入O1群霍乱弧菌抗血清，若细菌的活跃运动现象消失，称之为制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。
另外，螺旋体由于不易着色并有特征性的形态特点，亦可用不染色标本作暗视野显微镜观察。