生物分离工程(三版)(孙彦)03章
生物分离工程(三版)03章课件
的沉淀
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沉淀的定义
由于物理环境的变化而引起 溶质溶解度的降低、生成固体凝 聚物的现象，称为沉淀。
8
沉淀与结晶的区别
沉淀生成的固体颗粒是不定形的 结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则
成分非常复杂（除了目标产物外，还夹 杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等） 沉淀的纯度远低于结晶 多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产 品
4
初级分离概念
初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞 内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物 原料初步提取目标产物，使目标产物得到 浓缩和初步分离的下游加工过程。
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初级分离特点
分离对象：体积大、杂质含量高； 分离技术：低操作成本、适于大规模生产
6
沉淀分离－学习要点
识记：盐析和盐溶概念 理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉
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等电点沉淀-实现方式
在低离子强度下调整溶液pH值至等电点 在等电点的pH值下利用透析等方法降低
溶液的离子强，使蛋白质沉淀
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等电点沉淀-操作特点
等电点沉淀在较低的离子强度下进行， 因此沉淀操作结束后无需脱盐
与其它沉淀结合使用，例如在等电点附 近进行的盐析沉淀操作时可以获得更小 的蛋白质溶解度
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其他沉淀技术
聚合物沉淀
非离子型聚合物沉淀 聚电解质沉淀
重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质
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沉淀生成动力学-沉淀生长
异向生长 发生在沉淀生成初期，微细的蛋白质颗粒
为布朗粒子，沉淀生长为扩散速率控制 同向凝聚
较大的沉淀颗粒在搅拌剪切作用下通过碰 撞而进一步凝聚，生成大颗粒沉淀
高离子强度下的盐析
《生化分离工程》教案
第三节 细胞破碎
1固-液分离设备及其特点（重点）（35min）
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成（10min）
3常用的细胞破碎方法（重点）及其原理（难点）、机械破碎法所用设备（30min）
4细胞破碎率的测定（5min）
5细胞破碎研究方向（5min）
6小结及思考题（5min）
3滤饼的重量比阻rB
教后小结
学生对絮凝以及凝聚概念有清楚的理解，对发酵液的预处理基本掌握。
教案1
课时安排
4学时
教学次序
第3次课
授课题目
第二章细胞分离与破碎
第三节细胞破碎
1固-液分离设备
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成
3常用的细胞破碎方法及其原理、机械破碎法所用设备
4细胞破碎率的测定
5细胞破碎研究方向
2.严希康著，《生化分离工程》，化学工业出版社，北京，2001年2月
3.孙彦著，《生物分离工程》，化学工业出版社，北京，2005年3月
4.欧阳平凯，胡永红著，《生物分离原理及技术》，化学工业出版社，北京，2006年2月
5.谭天伟著，《生物分离技术》，第二版，化学工业出版社，北京，2007年8月
6.朱志强著，《超临界流体萃取技术原理》，化学工业出版社，北京，2001年8月（2）相关专业网站：
小木虫学术科研第一站：/
食品伙伴网：/
食品商贸网：/
食品工业网：/
食品科技网：/
教学难点
凝聚和絮凝的区别、滤饼的重量比阻rB
教学方法
讲授法、谈话法。多媒体辅助教学。
教学过程设计
第二章细胞的分离与破碎
第一节发酵液的预处理第二节固液分离
1发酵液预处理的目的（15min）和具体方法（重点30min）
生物分离工程 第二、三章综合测试
1第二章过滤和离心第三章细胞破碎一、名词解释、1.凝聚:就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，使胶粒的双层电位降低，排斥作用降低，使胶体体系不稳定，胶粒间因相互碰撞而产生凝聚的现象。
2.絮凝：当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联接，形成较大凝絮团的过程。
3.助滤剂：是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，滤速增大。
4.分离因数：是指离心设备所能达到的离心力与重力加速度的比值，用Z表示。
Z=4π2N2r/g5.盐溶：在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。
这种现象称为盐溶。
6.盐析：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。
7.包含体：外源基因表达的产物不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒。
8.高压匀浆法：也称高压剪切破碎法，是利用高压匀浆器破碎细胞的一种方法。
即细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。
9.珠磨法：是指在搅拌机的高速搅拌下微珠高速运动，微珠与微珠之间以及微珠和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。
10.酶溶法：酶溶法利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大细胞内产物的通透性。
11.超声破碎法：超声波破碎发是利用发射15~24kHZ的超声波探头处理细胞悬浮液。
是在超声波作用下发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。
12.空化现象：在相当高频率的超声波作用下，液体产生空穴泡，这种空穴泡在超声波继续作用下膨大和破碎，从而产生极强的剪切力，使细胞破碎。
13.有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶液，水的活性降低，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电集团或亲水集团的水化程度降低，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。
第03章 萃取分离技术 生物分离工程ppt
ln K ln KE ln KH ln K A (3-80)
其中，KE，KH和KA分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对 分配系数K的贡献。
影响分配系数的因素很多，加上各因素间又 互相影响， 定量地将蛋白质的一些分子性质与 分配系数关联起来是困难的。最佳的双水相操 作条件，还需要依靠实验来获得。
3.4.3 影响分配系数的各种因素
影响生物分子分配系数的因素很多：成相聚合物的分子 量和浓度、体系的pH、体系中盐的种类和浓度、 菌体或细 胞的种类和浓度、温度等等。 选择合适的条件，可以达到 较高的分配系数，选择性地萃取目标产物。
三步萃取流程示意图
如果第1步的选择性足 够大，可省略中间步 骤，在第3步中即将目 标产物分配于盐相， 以使目标产物与PEG分 离，便于PEG重复利用 和目标产物的进一步 加工处理。
连续双水相萃取流程
3.5 反微团萃取(Reversed micellar extraction)
3.5.1 反微团及其基本性质
20
PEG/盐 93 3.2 3.4
25
3．相平衡与相分离
双水相萃取过程包括：双水相的形成、溶质在双水相中的 分配和双水相的分离。
萃取在混合澄清槽或萃取塔中进行： 将固状(或浓 缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀浆液中，同时进行 机械搅拌使成相物质溶解，形成双水相。由于常用的 双 水 相 系 统 的 表 面 张 力 很 小 ( 如 PEG／ 盐 系 统 为 0 . 1 ~1mN／cm；PEG／Dex系统为1×10-4~0.1mN／cm)， 相间混合所需能量很低，通过机械搅拌容易分散成微 小液滴，相间比表面积极大。达到相平衡需时间很短 ，一般只露几秒钟。搅拌时只需较小的剪切力就能得 到分散度很高的悬浮液，能耗小。
第03章讲义 萃取分离技术 3.1 生物分离中的液液萃取 生物分离工程ppt
AH A H
(3-5)
BH BH
(3-6)
解离平衡常数分别为
[ A ][ H ]
k a [ AH ]
(3-7)
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kb
[ B ][ H ] [ BH ]
(3-8)
弱酸性溶质的萃取：弱酸在水相中部分电离，而在有机 溶剂中几乎不离解，在有机溶剂-水萃取体系中，表现分配 系数为：
[kkii((B A))]1 1[ kka a((B A))//[[H H ]]]
(3-14)
通过调节水相pH，控制溶质的分配行为，从而提高萃取 率的方法，广泛应用于抗生素和有机酸等弱电解质的萃取。
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例3-1 在醋酸戊酯-水系统中，青霉素K的ki＝215，青霉 素F的ki =131。根据有关手册的数据，pka值分别为 pka(K)=2.77, pka(F)=3.51，现有混合物青霉素F和K，而F 是有用的目的产物。
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如何得到满意的萃取效率？
1. 选择适当的萃取剂
尽量选择对溶质有较大分配系数k的萃取剂。良好 的萃取剂一般还应满足：
✓选择性好。化学稳定性好。 ✓易于分层：密度差较大，粘度小，表面张力适中，相 分散和相分离较容易，不产生第三相或产生乳化现象。 ✓萃取剂易于回收和再利用。 ✓萃取剂价廉易得，经济性好。 ✓毒性和环境污染小，闪点低，使用安全。
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2. 改变溶质的形态
生物产品的分离过程，不应使其丧失生物效能，这 就限制了萃取剂的选择范围。
通过适当改变溶质的形态，使分配系数k 改变，以 改进萃取分离。 具体方法主要有二，即通过溶质离子 对的变化和萃取体系pH值的改变来实现。
生物分离工程三版孙彦
产物的不溶及聚合已
成为结构基因组计划
Crystallized
Expressed
Purified
Crystal Structure NMR Structure
In PDB
Soluble
发展的制约因素。
生物分离技术与化工分离技术 的区别
化工分离技术：获得纯的化学物质 生物分离技术：在得到纯的生物物质同时，还必
《生物工程下游技术》 刘国诠主编，1993年 《Bioseparation Process Science》 Antonio A. Garcí a等
第一章 绪论
授课内容
生物下游加工技术简介
生物下游加工过程的特点
分离机理和分离操作
生物物质
分离效率的评价
学习目的和要求
总体要求：对本课程具有比较初步的认识； 掌握：生物下游加工技术的特点；生物分离
生物分离工程的萌芽
Golden Time概念的提出 血液制品的生产
生命科学的发展带动生物工程的进步
1953年，DNA双螺旋结构的发现 1972年，美国斯坦福大学构建了第一个重 组DNA分子 1996年，克隆羊“多利”诞生在英国的罗 斯林研究所 1990-2006，人类基因组计划 现在，生物信息、生物芯片、胚胎干细胞等
反应、响应、控制
免疫系统
机械分离 对象：非均相物系， 原理： 根据物质大小、 密度的差异进行分离 传质分离 对象：均相物系；
过滤 重力沉降 离心沉降 输送分离 原理：根据溶质在外力 作用下产生的移动速度 的差异实现分离 反渗透 反渗析 超滤
分 离 过 程
（速度分离法） 推动力：压力差、电位 梯度和磁场梯度 扩散分离 原理：根据溶质在两相 中分配平衡状态的差异 实现分离 （平衡分离法） 推动力：偏离平衡态的 浓度差 结晶 吸收、吸附和离子交换 萃取 蒸馏、蒸发 电泳和磁泳
生物分离工程(三版)(孙彦)02
区带形成条件
离心条件
在最前的沉降物质达到管底 前停止，短时间，低速度
使各组分沉降到其平衡的密 度区，长时间，高速度
细胞分离－离心设备分类
分类方法 处理量 温度 转速 名称 实验室用离心机，工业用离心机 常温离心机、冷冻离心机 低速离心机、高速离心机、超速离心机
转子结构
管式、碟式
细胞分离－常用离心设备
模型校正
形态校正：颗粒的形状系数 速度校正：空隙率函数
S
F ( )
A AP
提高重力沉降的途径
加入中性盐：双电层排斥电位降低 加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图 引入外力
细胞分离－重力沉降理论
模型校正
形态校正 速度校正
提高重力沉降的途径
加入中性盐； 加入高分子絮凝剂 引入外力
原核细胞
革兰氏阳性菌 细 胞 壁 由 肽 聚 糖 层 组 成 ， 壁 厚 约 1 5 ～ 5 0 nm， 肽 聚 糖 含 量 为 40~90%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。 细胞壁在肽聚糖的外侧还有分别由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多 糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越8～10 nm。
革兰氏阴性菌
胞内产物释放
细胞分离－重力沉降理论
理论假设
细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理； 颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒 之间无相互干扰
受力分析
球形颗粒重力fg
液体的浮力fb 颗粒运动方向相反的阻力 fs
细胞分离－重力沉降理论
重力：
1 3 f g d p s g 6
1 3 f b d p L g 6
胞内产物释放
－机械破碎之珠磨
09122生物分离工程
《生物分离工程》课程（09123）教学大纲一、课程基本信息（宋体五号加粗）课程中文名称：生物分离工程课程代码：09123学分与学时：52学时，3学分课程性质：专业必修授课对象：生物工程专业（本科）二、课程教学目标与任务《生物分离工程》是为生物工程本科专业学生开设的一门专业必修课，是本专业的一门主干课程。
本课程主要讲授各种生物活性物质中各种杂质的去除、分离、纯化和精制技术，是生物工程中不可缺少的组成部分，通过对本课程的学习，能使学生针对不同产品的特性，较好地运用各种分离技术来设计合理的提取、精制的工艺路线，并能从理论上解释各种现象，提高分析问题和解决问题的能力，是一门理论和实践密切结合的课程。
三、学时安排四、课程教学内容与基本要求第一章绪论（2学时）教学目的：了解生物分离工程的特点。
基本要求：掌握生物分离工程在生物工程领域的地位，生物分离过程的特点以及生物分离过程的分类。
重点与难点：准确理解生物分离过程的特点教学方法：多媒体教学主要内容：一、生物分离工程的历史及其应用二、生物分离工程在生物技术中的地位三、生物分离工程的特点四、生物分离一般步骤第二章生物分离的理论基础（4学时）教学目的：使学生了解生物分离的理论基础基本要求：了解生物分离的基本理论基础，掌握分离效率的评价标准。
重点与难点：分离机理、分离效价的评价标准教学方法：多媒体讲授主要内容：一、分离机理二、分离操作三、分离效价的评价第三章过滤（4学时）教学目的：学习并掌握发酵液过滤的基本理论基本要求：掌握过滤前物料预处理的基本方法，过滤的基本理论及相关方程，了解连续旋转式真空抽滤机的操作原理与过程，以及过滤设备的基本结构及选择原则。
重点与难点：准确理解过滤的基本理论及相关方程、过滤设备的基本结构与选型。
教学方法：多媒体课件教学与课堂讨论相结合主要内容：一、过滤的基本概念二、过滤前物料的前处理1、加热（Heating）——降低液体粘度2、凝聚和絮凝三、影响凝聚作用的主要因素四、絮凝作用五、常用的絮凝剂六、助滤剂七、过滤理论八、连续旋转式过滤机九、过滤设备及其结构十、过滤介质十一、典型的过滤设备1、板框压滤机2、旋转过滤机第四章离心与沉降（4学时）教学目的：掌握离心和沉降的基本原理基本要求：掌握颗粒沉降的计算，了解各种分离沉降设备的种类、结构和原理，离心分离过程的放大方法。
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温度和pH值
在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内 随着温度升高而增大 在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水 化层并导致蛋白质溶解度的降低
生物分离工程
初级分离技术
总体பைடு நூலகம்习目的和要求
了解蛋白质表面特性，掌握各种 沉淀和泡沫分离的原理、特点以
及应用范围。
目录
引言 沉淀分离
蛋白质表面特性 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 热沉淀 其他沉淀法 沉淀生成动力学
泡沫分离
引言－学习要点
识记：初级分离概念 理解：初级分离特点
的各种因素 应用：掌握盐析操作过程
盐析沉淀-盐析的定义
定义
蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发 生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）
溶解度与I的关系－Cohn方程
log S K S I
盐析沉淀-盐析原理
低离子强度下的盐溶
向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子， 而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质 的溶解度增大，发生盐溶
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
胶体的性质
比表面增大，界面现象重要
强烈的尺寸效应
蛋白质表面特性－蛋白质性质
蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量约6～1000 kDa，分子直径约为1~30 nm。 在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的 部分性质
蛋白质表面特性
－沉淀策略及方法
策略
破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
蛋白质表面特性
－常用的沉淀技术
盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 聚合物沉淀 热沉淀
盐析沉淀-学习要点
识记：盐析和盐溶概念 理解：盐析沉淀的原理，影响盐析
蛋白质的两性电离和等电点
蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受pH影响。
蛋白质的变性
物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、 超声波的作用等；
化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。
蛋白质表面特性－沉淀屏障
蛋白质分子周围的水化层
水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层 胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力”
初级分离概念
初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞 内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物 原料初步提取目标产物，使目标产物得到 浓缩和初步分离的下游加工过程。
初级分离特点
分离对象：体积大、杂质含量高； 分离技术：低操作成本、适于大规模生产
沉淀分离－学习要点
识记：盐析和盐溶概念 理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉
高离子强度下的盐析
溶液主体中那些与扩散层反离子电荷符号相同的电解质离子 将把反离子压入（排斥）到双电层中
由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使 蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用
盐析沉淀-盐析原理图示
盐析沉淀-影响盐析因素
蛋白质的分子量和结构
无机盐种类和浓度
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
20
40
60
80
100
％ of saturation of ammonium sulphate
Typical ammonium sulphate precipitation ranges for proteins from a crude extract in supernatant. (●) EGFP relative content in supernatant, (■)total protein relative content in supernatant
蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势
结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基
暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液 体，而是具有两相的微不均匀 分散体系。
盐析沉淀-无机盐的选择
溶解度大 可配制成具有较高离子强度的 无机盐溶液
溶解度受温度的影响较小 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉
降或离心分离。
盐析操作-沉淀剂性质
对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其性 质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、饱 和浓度等），是必需的。
以硫酸铵为例： 20℃下，饱和浓度为4.05 mol/L（相当于534 g/L）
饱和密度为1.235 kg/L； 0℃下，饱和浓度为3.825 mol/L（相当于505 g/L）
盐析操作-溶解度曲线确定
离心分离 沉淀物并 重新溶解 测定其中 总蛋白和 目标蛋白 的浓度
以饱和度 为横坐标， 上清液中 总蛋白和 目标蛋白 浓度为纵 坐标，得 到蛋白质 溶解度曲 线
1
protein relative content in supernatant )
分子间的静电排斥作用
根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反 电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四 周为离子氛所包围。当两个胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛 发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了 原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从 浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶 粒受到斥力而相互脱离。
沉淀技术适用范围
沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。 一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过 程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实 际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的 工业实例。
蛋白质表面特性－蛋白质组成
蛋白质组成
20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性 氨基酸和亲水性氨基酸
淀方法的原理和影响因素 应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质
的沉淀
沉淀的定义
由于物理环境的变化而引起 溶质溶解度的降低、生成固体凝 聚物的现象，称为沉淀。
沉淀与结晶的区别
沉淀生成的固体颗粒是不定形的 结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则
成分非常复杂（除了目标产物外，还夹 杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等） 沉淀的纯度远低于结晶 多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产 品