实验二细菌基本形态及特殊形态观察
实验二普通显微镜的使用及细菌形态观察
动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进展观察时，物象 将保持根本聚焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 〔parfocal〕。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍 镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节 器即可对物像清晰聚焦，从而防止由于使用粗调节器时可 能的误操作而损坏镜头或载玻片。
实验二 普通光学显微镜的使用 和细菌形态观察
一 实验目的
1、学习并掌握油镜的原理和使用 方法。
2、学习普通台式显微镜的构造、 各局部的功能和使用方法。
3、了解细菌的三种根本形态
二、根本原理
微生物是个体微小、构造简单、肉眼无法看到的 微小生命体。因此，我们要借助显微镜来进展观 察。显微镜的种类很多，但根本构造可分为两大 局部 ：一是机械装置，二是光学系统
在聚光器的数值孔径确定后，假设需要改变光照强度， 可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原那么上不 应再通过光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度 和照明光源强度的使用原那么也不是固定不变的，只要能 获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活 运用，不一定拘泥不变。
2、显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能 到达的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初 学者，进展显微观察时应遵从由低倍镜到高倍镜再到油镜的 观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定 检查的位置。
显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体 〔两端〕两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
：可见光的波长〔平均0.55 m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
免疫学实验报告
实验一免疫学实验一、免疫细胞检测：1、淋巴细胞转化试验2、E花环形成试验3、大吞噬试验4、小吞噬试验二、凝集试验（玻片法）凝集+ 不凝集-细菌鉴定结果：三、酶联免疫吸附试验（ELISA）示教原理：结果：实验二细菌形态观察及革兰染色一、观察细菌的基本形态：1、球菌2、杆菌3、螺形菌葡萄球菌大肠杆菌霍乱弧菌（革兰染色）（革兰染色）（革兰染色）二、观察细菌的特殊结构：1、芽胞2、荚膜3、鞭毛破伤风杆菌肺炎链球菌伤寒杆菌（革兰染色）（荚膜染色）（镀银染色）三、革兰染色1、步骤：2、结果：葡萄球菌呈色，为革兰性菌；大肠杆菌呈色，为革兰性菌。
3、简述革兰染色的技术关键及医学意义。
实验三细菌人工培养及其代谢产物的观察一、常用培养基的制备：1、怎样配制100ml普通肉汤培基？2、含有%琼脂的培基为固体培基，制成平板用于；制成斜面用于。
3、含有%琼脂的培基为半固体培基，主要用于。
二、细菌在培养基中的生长情况1、平板划线分离培养结果（记录菌落形态）2、在液体培基中的生长情况：葡萄球菌：枯草杆菌：链球菌：3、在半固体培基中穿刺接种培养结果伤寒杆菌呈生长，运动；痢疾杆菌呈 生长， 运动。
三、细菌代谢产物的观察 1、糖发酵试验：产酸产气产酸不产气＋ 不分解－2、蛋白质分解试验：阳性＋阴性－3、细菌的色素：4、简述细菌代谢产物检查的意义。
实验四消毒灭菌与细菌分布试验一、记录并分析细菌分布检查的结果：根据上述检查结果，简述其在医学、药学工作中的实际意义。
二、高压蒸汽灭菌常用压力、温度及时间为：高压蒸汽灭菌器的使用要注意的是：三、紫外线杀菌试验1、培养后菌苔生长情况（绘图）：2、简述紫外线杀菌的特点及适用范围。
实验五药物的抗菌试验一、琼脂扩散法1、纸片法2、打孔法二、液体培养基连续稀释法（试管法）药物：浓度：菌种：结果：报告MIC：实验六病原性细菌一、观察下列细菌形态并绘图链球菌淋杆菌结核杆菌（革兰染色）（革兰染色）（抗酸染色）二、化脓性球菌1、葡萄球菌：阳性＋阴性－2、链球菌：3、抗链球菌溶血素“O”试验（简称抗“O”或ASO试验）：抗体效价为：简述其原理及临床意义：三、肠道杆菌：1、观察大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌在SS平板和双糖铁培养基中的菌落特点、生化反应、动力等。
实验2 细菌的染色和形态观察
微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张 /人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
思考题
1. 革兰染色的过程如何？
2. 有时候革兰阳性菌被染成革兰阴性菌的色调，
这是为什么？
革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘
阳
酒
杆
红,
阴,
一
阳
一
紫
半
阴半Leabharlann 红脑 淋 卡，白 抗 胞 除外
革兰氏染色的意义：
将细菌分为革兰阳性、阴性两大类。
分析细菌的致病性。 指导临床用药。
革兰染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌 苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm 的膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、革兰染色过程： 初染：结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 5、镜检：阳紫阴红 球阳杆阴
实验二细菌的观察
细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。
染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。
酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。
革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。
当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。
一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。
革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。
革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。
2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。
3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。
四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。
细菌形态观察实验报告
一、实验目的1. 掌握显微镜油镜的使用方法。
2. 观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
3. 了解细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢等。
4. 培养对细菌形态结构的识别能力。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有多种形态结构。
通过显微镜观察，可以了解细菌的基本形态和特殊结构，为细菌的分类、鉴定和致病性研究提供依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细菌样本、革兰氏染色液、芽孢染色液、水浸片、盖玻片、载玻片等。
2. 仪器：光学显微镜、酒精灯、载物台、切片刀、镊子等。
四、实验步骤1. 观察细菌样本（1）将细菌样本滴在载玻片上，用盖玻片封口。
（2）在显微镜下观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
2. 革兰氏染色（1）将革兰氏染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其革兰氏分类。
3. 芽孢染色（1）将芽孢染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其芽孢存在与否。
4. 观察细菌特殊结构（1）观察细菌是否有鞭毛、荚膜等特殊结构。
（2）通过水浸片观察细菌的运动。
五、实验结果与分析1. 细菌样本的基本形态结构（1）观察到的细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等基本结构。
（2）部分细菌具有鞭毛、荚膜等特殊结构。
2. 革兰氏染色结果（1）部分细菌呈现革兰氏阳性，细胞壁较厚，不易着色。
（2）部分细菌呈现革兰氏阴性，细胞壁较薄，易着色。
3. 芽孢染色结果（1）部分细菌存在芽孢，呈圆形或椭圆形。
（2）部分细菌无芽孢。
4. 细菌特殊结构观察结果（1）部分细菌具有鞭毛，呈螺旋状。
（2）部分细菌具有荚膜，呈透明状。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了显微镜油镜的使用方法。
2. 观察了细菌的基本形态结构和特殊结构，了解了细菌的生物学特性。
3. 培养了对细菌形态结构的识别能力，为今后的学习和研究奠定了基础。
七、注意事项1. 使用显微镜时，注意调节光圈和焦距，确保观察清晰。
实验二细菌基本形态及特殊形态观察
四 实验内容及步骤
1 细菌基本形态观察 2 细菌特殊结构观察 3 细菌运动性观察悬滴片的制作。
1 细菌基本形态观察
学习油镜的正确使用方法。 用油镜观察——
大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌
菌体
2 细菌特殊结构观察
学习油镜的正确使用方法。 用油镜观察细菌特殊结构—— 芽孢
钾细菌荚膜（高倍镜） 枯草芽孢杆菌芽孢（油镜）
思考题
（1）观察细菌染色片时应如何调节光线？ （2）油镜观测时，是否可以除香柏油以外的其它液体作介质？
低，难于染色，但一旦被染
色又难于脱色。因此先用强
着色力的染料（孔雀绿）处
理，并同时加热，使菌体以
及芽孢均着色，后使菌体脱
色，而芽孢保留原色，经复
染（蕃红），菌体与芽孢分
芽
孢
菌 体
别以不同颜色显现。
菌芽 体孢
对有芽孢的菌体进行简单染 菌体 色（只用一种染料染色）。 菌体和芽孢着色情况如何？
芽孢
5 鞭毛染色 及运动观察
目镜
物镜
10 X 100X
⑵ 显微镜的分辨率
油镜比低倍镜、高倍镜观察物体更清晰。
原因： ◆ 油镜分辨率高于低倍镜、高倍镜 ◆ 油镜汇聚光线的能力大于低倍镜、高倍镜
◆ 分辨率是指显微镜能够分辨的最小距离即鉴别限度（R）
R=λ∕2NA
(λ为入射光波波长； NA为显微镜数值孔径)
NA= η.sinθ
１ 普通光学显微镜的结构
（1 ) 机械系统 包括镜座、镜臂、载物台、物镜转换器、镜筒及调节器等
（2 ) 光学系统 包括反光镜、聚光器、物镜、目镜等。
２ 普通光学显微镜的光学成象原理
（1）显微镜的放大倍数 放大倍数：目镜的放大倍数与物镜的放大倍数之乘积 。
实验二_病原菌形态观察
形态差异是子囊菌分类的重要依据
1、半子囊菌纲 ：子囊裸生，无子囊果。 2、不整囊菌纲：子囊果是闭囊壳，子囊无
规律地散生在闭囊壳内 3、核菌纲：子囊果是闭囊壳(子囊有规律
地排列在闭囊壳内)或子囊壳 4、腔菌纲：子囊果是子囊座 5、盘菌纲：子囊果是子囊盘
（一）半子囊菌纲
低等子囊菌，子囊裸生，无子囊果。子囊壁 薄，无孔口，靠壁的肿胀或消解来释放子囊 孢子。 与植物病害相关只有一个目：外囊菌目 外囊菌目只有一个属：外囊菌属
外囊菌属（Taphrina）
桃
子囊及
缩
子囊孢
叶
子
病
的
症
状
子囊长圆筒形,平行排列在寄主表面。缩叶病 （T.deformans）
（二）不整囊菌纲
（6）盘梗霉属（Bremia lactucae）孢囊梗 二叉状锐角，末端膨大呈盘状。
（7）白锈菌属 （Albugo）孢子囊 梗平行排列在寄主 表皮下，短棍棒形； 孢子囊串生。
四 子囊菌亚门真菌的基本形态
• 是真菌中数量最多的一个类群，称子囊菌 • 营养体一般都是分支繁茂的有隔菌丝体 • 无性繁殖一般都是在由菌丝分化的分生孢
• 引起大、小麦等 赤霉病。
（四） 腔菌纲（Loculoascomycetes）
子囊果是子囊座，子囊双层壁。
痂囊腔菌属（Elsinoe）
• 圆形子囊单生于
子座内的子囊腔 中；子囊孢子大 多长圆筒形，有3 个横隔。 • 引起葡萄黑痘病 等。
（五） 盘菌纲 (Discomycetes）
• 子囊果盘状或杯状，故称子囊盘。 • 子囊和侧丝形成一层子实层长在盘上。
• 子囊果是闭囊壳 • 子囊无规律地散生在闭囊壳内，子囊成
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四 实验内容及步骤
1 细菌基本形态观察 2 细菌特殊结构观察 3 细菌运动性观察悬滴片的制作。
1 细菌基本形态观察
学习油镜的正确使用方法。 用油镜观察——
大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌
菌体
2 细菌特殊结构观察
学习油镜的正确使用方法。 用油镜观察细菌特殊结构—— 芽孢
钾细菌荚膜（高倍镜） 枯草芽孢杆菌芽孢（油镜）
五 实验报告
绘 大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌形态示意图
绘 荚细菌荚膜 枯草芽孢杆菌芽孢形态示意图
菌 名：枯草杆菌 放大倍数：16×100 X
细菌形态示意图绘图要求：
① 选择形态典型的部分细菌细胞绘图。 ② 仅绘出细菌细胞轮廓，但不同细菌的细胞大小比例应 适宜，且形态上应有所区分。 ③ 细菌与视野相对大小应符合实际，应将细菌细胞排布 在视野中离开中心的部位（即绘空心图）。 注明菌名、放大倍数。
η为标本、物镜之间介质的折射率。 θ为光轴上物点发出的光线与物镜有效直径两端最大夹角角度的
一半。
η低倍镜= η高倍镜=η空气=1.0 ， η油镜η香柏油=1.52 θ低倍镜< θ高倍镜< θ油镜 ， sinθ低倍镜< sinθ高倍镜< sinθ油镜
NA低倍镜< NA高倍镜< NA油镜 所以，油镜的分辨力比高倍镜、低倍镜高。
菌胶团
荚膜 菌体
3 细菌运动性观察悬滴片的制作。
土壤细菌菌悬液培养液。
观察注意要点： （光线要暗）
油镜使用主要步骤
▲观察前准备 ：显微镜的准备和调试视野明亮 ▲低倍镜观察 ▲高倍镜观察（此步可以省略） ▲油镜观察：加香柏油，油镜头浸入香柏油中后调焦 ▲显微镜油镜头的清洗和归位（二甲苯清洗）
注意 ！！！ —— 显微镜调焦方法
目镜
物镜
10 X 100X
⑵ 显微镜的分辨率
油镜比低倍镜、高倍镜观察物体更清晰。
原因： ◆ 油镜分辨率高于低倍镜、高倍镜 ◆ 油镜汇聚光线的能力大于低倍镜、高倍镜
◆ 分辨率是指显微镜能够分辨的最小距离即鉴别限度（R）
R=λ∕2NA
(λ为入射光波波长； NA为显微镜数值孔径)
NA= η.sinθ
低，难于染色，但一旦被染
色又难于脱色。因此先用强
着色力的染料（孔雀绿）处
理，并同时加热，使菌体以
及芽孢均着色，后使菌体脱
色，而芽孢保留原色，经复
染（蕃红），菌体与芽孢分
芽
孢
菌 体
别以不同颜色显现。
菌芽 体孢
对有芽孢的菌体进行简单染 菌体 色（只用一种染料染色）。 菌体和芽孢着色情况如何？
芽孢
5 鞭毛染色 及运动观察
思考题
（1）观察细菌染色片时应如何调节光线？ （2）油镜观测时，是否可以除香柏油以外的其它液体作介质？
细菌鞭毛直径极微小 （约10---20nm）,一般 用电镜观察，但采用特 殊染色后，在普通光镜 下也可观察到。其原理 是先用媒染剂处理，使 之沉积于鞭毛上，从而 加粗鞭毛外观直径，然 后再进行染色。
有鞭毛的菌体可以运动。
三 实验材料
▲细菌基本形态标本片：大肠杆菌片 枯草杆菌片 金黄色葡萄球菌片
▲ 细菌特殊形态标本片：钾细菌荚膜片 枯草芽孢杆菌芽孢片
１ 普通光学显微镜的结构
（1 ) 机械系统 包括镜座、镜臂、载物台、物镜转换器、镜筒及调节器等
（2 ) 光学系统 包括反光镜、聚光器、物镜、目镜等。
２ 普通光学显微镜的光学成象原理
（1）显微镜的放大倍数 放大倍数：目镜的放大倍数与物镜的放大倍数之乘积 。
目镜 ：
物镜
低倍镜：10X 高被镜：40X 油镜：100X
实验二 细菌基本形态及 特殊形态观察
一 目的要求
1 了解普通光学显微镜原理及构造。 2 学习并掌握普通光学显微镜油镜的正确使用方法。★ 3 用油镜观察细菌基本形态。 4 了解负染色原理、细菌芽孢染色基本原理，油镜观察细 菌的荚膜、芽孢及观察有鞭毛细菌的运动。
二 基本原理
１ 普通光学显微镜的结构 ２ 普通光学显微镜的光学成象原理 3 荚膜染色 4 芽孢染色 5 鞭毛染色及细菌运动
汇聚光线的能力油镜高于低倍镜、高倍镜。
3 荚膜染色
主要成分多为糖 类，无色透明且 不易着色常用负 染色观察。负染 色是将细菌细胞 和背景着色，从 而把无色透明、 不着色的荚膜结 构衬托显现出来。
菌体 荚膜
菌胶团：
多个菌体的荚膜融合为一个团状物，内有多个菌体。
菌胶团
4 芽孢染色
细菌芽孢壁厚而致密，透性