Microarray_Printing基因微阵列打印
关于差异表达基因的几种筛选方法
【关键词】 mRNA 差异显示；基因表达；DNA 微阵列 【摘要】 多种因素导致的基因差异性表达与疾病的发生发展密切有关，分离 差异表达基因，对于研究细胞生命过程的调节机制及致病机制具有重要意义. 20 世纪 90 年代以来，先后出现了 mRNA 差异显示 PCR（mRNA DDRTPCR）、代表性差异 分析（RDA）、抑制性消减杂交（SSH）、基因表达连续性分析（SAGE）和 DNA 微阵 列（DNA microarray）等多种分析差别表达基因的方法. 我们对以上方法的原理、 基本步骤及其应用进行简要综述. 【关键词】 mRNA 差异显示；基因表达；DNA 微阵列 0 引言 随着各类基因组计划的相继完成，人类面临的更艰巨的任务是研究基因功能活 动，也就是说基因组序列分析仅仅代表了遗传信息复杂性的一个层次，而遗传信息 有序地、时相地表达则是决定生物体及其行为的另一个层次. 所以，发现不同生物 体及其组织在各种状态下（正常状态、发育、衰老、损伤及疾病）差异表达的基因 具有十分重要的意义，于是差异表达基因筛选技术应运而生. 目前，基因表达差异 的分析通常用稳定状态下 mRNA 的丰度高低及有无进行比较. 差异表达基因有两个 含义，即表达基因的种类变化和基因表达量的变化. 传统的基因分析方法如 Northern 杂交、斑点杂交等存在费时、费力的缺点，已不适宜进行大规模基因表 达分析研究的需要. 因此随着分子生物学的发展，出现了大量新方法，按其技术特 点可分为三类：①以杂交为基础的技术，包括 Northern blotting， Slmapping/Rnase 保护、抑制性消减杂交和 DNA 微阵列；②以 PCR 为基础的技术， 如差异显示 PCR（DDPCR）、代表性差异分析（RDA）；③以测序为基础的技术，如 表达序列标签（EST）、基因表达连续性分析（SAGE）等. 我们对目前主要的差异 表达基因的筛选方法作一综述. 1mRNA 差异显示 PCR(differential display PCR，DDPCR) mRNA 差异显示 PCR 又称为差别显示反转录 PCR（differential display reverse transcription PCR， DDRTPCR）. DDRTPCR 技术［1-3］最早于 1992 年 出现，可以用于分离在不同的真核细胞中差异表达的 cDNA 并加以克隆. 其原理是 将两种细胞的 mRNA 逆转录后进行 PCR 扩增. PCR 3′端引物序列是针对 mRNA 的 poly(A)尾设计的，一般是 11 个 T 再加上两个碱基，这样 12 种 3′端引物 (T11AA，T11AC， T11AG，T11AT，T11CA，T11GA，T11CC，T11CG，T11CT，T11GC， T11GG，T T11GT)就可以与所有 mRNA 的 poly(A)尾匹配；5′端引物是随机引物， 一般为 10 个碱基，因此产生一些不同长度的 cDNA 片段，电泳后比较两者的差别而 得到差异表达基因的 cDNA. 但这个方法存在许多严重的缺陷，它的 5′端随机引物 一般常有 2～3 个碱基不能与 cDNA 模板完全匹配，而且 PCR 反应中随机性、偶然性 比较大，容易形成非特异性扩增而造成高的假阳性率，这就使下游的筛选工作很巨 大. 理论上此方法可以检测到 95％以上的转录体，但由于引物序列的随机性和竞 争性模板结合位点的存在，很难确定实际的原始 RNA 丰度. 尽管有上述缺陷，但由 于其实验步骤较简单，此方法在实际工作中应用仍较多，例如用于筛选在肿瘤发
C7 基因芯片技术简介
7.2 生物芯片的分类
按载体材料分： • 玻璃芯片：荧光背景低、应用方便，
材料易得，应用最广泛。 • 硅芯片 • 陶瓷芯片
按点样方式分
• 原位合成（ loci-synthetic DNA ）芯片 ：利用半导体光
蚀刻技术原位合成一定长度（~20 bp）的寡核甘酸片段。
• 微阵列（ microarray ） 芯片 ： DNA 直接点样（针点或喷
靶基因样品的标记
• 靶基因样品被标记后，与芯片上的探针分子杂交。
• 荧光标记；生物素和放射性同位素标记
• 双色荧光标记：常用标记物为荧光素Cy3和Cy5 ，分别用来 标记两中不同的样品（如样品和对照）。 • cy3：激发波长550 nm，发绿色荧光。 cy5：激发波长649 nm，发红色荧光。
标记方法
基因芯片技术的发展简史
Southern & Northern Blot
Dot Blot
Macroarray
Microarray
• 1989年，Southern获得在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及 杂交法测序的专利 • 1992年， Affymetrix公司成功应用光导向平板印刷技术， 直接在硅片上合成寡核甘酸点阵的高密度芯片，是世界上 第一块原位合成的基因芯片。 • 1997年，美国Stanford大学Brown实验室，制作了世界上 第一张全基因组芯片（含有6116个基因的酵母全基因组芯 片）。
7.5 基因芯片的应用
• • • • • • • • 基因表达分析 基因型及多态分析 杂交测序 核酸和蛋白质相互作用的研究 疾病的诊断与治疗 药物开发 营养与食品卫生领域 环境科学领域
参考书
• 马文丽 等，DNA芯片技术的方法与应用， 广东科技出版社，2002 • 马立人等，生物芯片，化学工业出版社， 1999（第一版）
微阵列名词解释
微阵列名词解释介绍如下:
微阵列（microarray）是基因芯片技术的一种，它是一种用于检测大量的DNA、RNA或蛋白质的平台。
微阵列技术用于评估基因和蛋白质的表达模式，以研究复杂疾病发病的机制、诊断和治疗。
微阵列技术的核心部分是由数千到数百万个小的“探针”组成的芯片。
这些探针可以精确地探测目标分子（如DNA、RNA或蛋白质），并测定其在样本中的数量和表达水平。
使用微阵列技术，研究人员可以比较正常、疾病或治疗后人体中基因或蛋白质的表达水平，以此来确定哪些基因或蛋白质与疾病相关。
微阵列技术的应用非常广泛。
在生物学研究中，微阵列技术可用于检测细胞中的大量基因表达水平，以便确定其与细胞功能、代谢途径和发育等方面的联系。
在医学研究中，微阵列技术可以加速疾病的诊断和治疗。
例如，它可以帮助确定肿瘤细胞基因表达的差异，从而指导治疗方案的制定和个体化治疗的选择。
总之，微阵列技术是一种用于检测大量基因表达的高通量技术，具有广泛的应用前景。
通过微阵列技术，可以了解基因与疾病之间的关系，从而在医学诊断和治疗上提供更准确、更有效的解决方案。
功能基因组研究方法
功能基因组研究方法功能基因组学是一种研究基因产物在特定情况下（如特定发育阶段或疾病）的动态表达，并尝试建立基因型（功能）与表型联系的模型。
以下是功能基因组学的一些常见研究方法：1. 基因敲除（Knockout）：通过随机突变或特定的基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）使细胞或生物体失去一个或多个基因的功能，以研究该基因的功能。
2. 基因过表达（Overexpression）：通过转染或转化技术使细胞或生物体表达更多的特定基因，以研究该基因的功能。
3. RNA干扰（RNAi）：利用RNA干扰技术来抑制或减少特定基因的表达，以研究该基因的功能。
4. 转录组学（Transcriptomics）：研究所有基因的转录产物（mRNA或非编码RNA）的表达和调控。
5. 基因芯片（Gene chips）：用于测定基因表达水平的高通量技术，可在同一实验中同时分析数千个基因的表达水平。
6. 体内或体外分子相互作用研究（In vivo or In vitro molecular interaction studies）：通过分析蛋白质和DNA、RNA等分子之间的相互作用，以了解它们之间的功能和关系。
7. Microarray 微阵列芯片（Microarray）是DNA探针的集合，探针通常是“喷墨印刷”在载玻片（Agilent）上或原位合成（Affymetrix）的挂衣核苷酸链（oligo）。
来自目标样品的标记单链DNA或反义RNA片段在特定调节下与DNA微阵列杂交，随后检测特定探针的杂交量。
杂交量与样品中的核酸片段数量成正比。
Microarray可分为：单色和双色。
以上信息仅供参考，如需获取更多详细信息，建议查阅相关书籍或咨询专业人士。
基于微阵列的比较基因组分析
微阵列芯片（Microarray）以高密度阵列为特征。
其基础研究始于20世纪80年代末，本质上是一种生物技术，主要是在生物遗传学领域发展起来的。
微阵列分为cDNA微阵列和寡聚核苷酸微阵列.微阵列上"印"有大量已知部分序列的DNA探针,微阵列技术就是利用分子杂交原理,使同时被比较的标本(用同位素或荧光素标记)与微阵列杂交,通过检测杂交信号强度及数据处理,把他们转化成不同标本中特异基因的丰度,从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异.微阵列技术是一种探索基因组功能的有力手段.其发展契机主要来自于现代遗传学的一些重要发现，并直接收益于该领域的某些重要研究成果，即在载体上固定寡核苷酸的基础上以杂交法测序的技术。
因此发展早期，微阵列芯片有时被通俗的称为“生物芯片（Biochip）”，目前媒体和科普读物中仍然常用该名称。
微阵列芯片经过近十年的主要发展期，国内外学术界渐渐采用名称Microarray（微阵列芯片），而Biochip（生物芯片）由于这名称容易混淆微阵列芯片和微流控芯片，渐渐该领域用的越来越少了。
比较基因组杂交技术比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH）是自1992年后发展起来的一种分子细胞遗传学技术，它通过单一的一次杂交可对某一肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。
其基本原理是用不同的荧光染料通过缺口平移法分别标记肿瘤组织和正常细胞或组织的DNA制成探针，并与正常人的间期染色体进行共杂交，以在染色体上显示的肿瘤与正常对照的荧光强度的不同来反映整个肿瘤基因组DNA表达状况的变化，再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究。
CGH技术的优点：1.实验所需DNA样本量较少，做单一的一次杂交即可检查肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化。
2.此法不仅适用于外周血、培养细胞和新鲜组织样本的研究，还可用于对存档组织的研究，也可用于因DNA量过少而经PCR扩增的样本的研究。
基因芯片
基因芯片样品的处理过程
操作的规范化
避免外源 RNase的污染
RNA分子降 解的防范
将组织立即冻存在液氮中同样，为了最大 限度地减少RNA的降解，组织块要足够小 以保证整个组织迅速彻底地冷冻
抑制内源性RNase 的活力
基因芯片样品的处理过程
RNA提取方法的选择 RNA纯化的目的：目标1：选择合适的细胞膜溶解方法。 目标2：保证能够抑制所有核糖核酸酶。 目标3：选择一种方法去除样品蛋白质。 目标4：选择核酸浓缩的方法。 目标5：选择合适的储存条件保存纯化 的RNA。
荧光标记的过程
不同标记方法 直接标记(direct labeling)是采用酶学或化学手段，通过荧光 染料直接与样品核苷或磷酸戊糖骨架共价结合，杂交后直 接检测荧光信号。 间接标记(indirect labeling)：是通过利用树状聚合物分子、 抗体或其他试剂把荧光染料分子以非共价和间接的方式连 接到样品分子上，杂交后对偶联染料进行检测。 利用Klenow聚合酶标记 其他标记方法
基因芯片操作技术
基因芯片
基因芯片（gene chip），是一块带有DNA微阵列 （microarray）的特殊玻璃片或硅芯片片，在数平方 厘米之面积上布放数千或数万个核酸探针；检体中 的DNA、cDNA、RNA等与探针结合后，借由荧光或 电流等方式侦测。经由一次测验，即可提供大量基 因序列相关信息。它是基因组学和遗传学研究的工 具。研究人员应用基因芯片就可以在同一时间定量 的分析大量（成千上万个）的基因表达，具有快速、 精确、低成本之生物分析检验能力。
用于基因表达谱分析的待测样品标记
转录后cDNA的标记 具体步骤如下： 在利于全长cDNA合成的条件下利用未修饰的dNTPs进行 反转录反应。 二、将DNA聚合酶、RNase H、大肠杆菌DNA连接酶和 dNTPs与第一链cDNA混合完成第二链合成。 三、以产生的双链cDNA为模板，利用高浓度的合适的 DNA聚合酶如具有外切酶活性的Klenow酶进行标准的随 机引物标记反应，生成完整双链cDNA的标记产物。这一 步可以采用然后偶联的dNTPs直接标记，也可以通过氨基 化的dNTP间接标记。
微阵列数据分析（MicroarrayDataAnalysis）
微阵列数据分析（MicroarrayDataAnalysis）蔡政安副教授（台湾前⾔在⼈类基因组测序计划的重要⾥程碑陆续完成之后，⽣命科学迈⼊了⼀个前所未有的新时代，在⼈类染⾊体总长度约三⼗亿个碱基对中，约含有四万个基因，这是⽣物学家⾸次以这么宏观的视野来检视⽣命现象，⽽医药上的研究⽅针亦从此改观，科学研究从此正式进⼊后基因组时代。
微阵列实验(Microarray)及其它⾼通量检测(high-throughput screen)技术的兴起，⽆疑将成为本世纪的主流；微阵列实验主要的优势在于能同时⼤量地、全⾯性地侦测上万个基因的表达量，通过基因芯⽚，可在短时间内找出可能受疾病影响的基因，作为早期诊断的⽣物标记(biomarker)。
然⽽，由于这⼀类技术的⾼度⾃动化、规模化及微型化的特性，使得他们所⽣成的数据量⾮常庞⼤且数据形态⽐⼀般实验数据更加复杂，因此，传统统计分析⽅法已经不堪使⽤。
在此同时，统计学家并未在此重要时刻缺席，提出⾮常多新的统计理论和⽅法来分析微阵列实验数据，也⼴受⽣物学家所使⽤。
由于微阵列数据分析所牵涉的统计问题层⾯相当⼴且深⼊，本⽂仅针对整个实验中所衍⽣的统计问题加以介绍，并介绍其中⼀些新的图形⼯具⽤以呈现分析结果。
基因芯⽚的原理微阵列芯⽚即⼀般所谓的基因芯⽚，也是基因组计划完成后衍⽣出来的产品，花费成本虽⾼，但效⽤⽆限，是⽬前所有⽣物芯⽚中应⽤最⼴的，由于近年来不断改进，也是最有成效的⽣物技术。
⼀般⽽⾔，基因芯⽚是利⽤微处理技术，先把⼈类所有的基因分别固着在⼀⼩范围的玻璃⽚(glass slide)、薄膜(membrane)或者硅芯⽚上；然后，可以平⾏地、⼤量地、全⾯性地侦测基因组中mRNA的量，也就是侦测基因的调控及相互作⽤表达。
⽬前微阵列芯⽚⼤致分为以下两种平台:cDNA芯⽚及⾼密度寡核⽢酸芯⽚(high-density oligonucleotide)，两种系统⽆论在芯⽚的制备及样本处理上都有相当的差异，因此在分析上也略有不同，以下便就芯⽚的特性简略介绍。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
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Microarray Printing 基因微阵列打印
陈光磊
厦门大学模式识别与智能系统研究所
Play the video microarryer.flv
High Through-put Printer for Whole Genome Chips 图片出处：/people/macampbell/CSU/Introscanners.html
In Action
1:00
perfusion pump for the wash well
1：25 清洗池的灌注泵 1：45 又在同一组玻片上点了一次
注意到视频右下角的英文缩写了吗？ HHMI(HOWARD HUGHES MEDICAL INSTITUTE霍华德·休斯医学研究会） 成立于1953年，是一家为全美科学家提供资助的富有卓越声望的非盈 利型研究机构. HHMI, a non-profit medical research organization that ranks as oneof the nation's largest philanthropies, plays a powerful role inadvancing biomedical research and science education in the U.S. Inthe past two decades HHMI has made investments of more than $8.3billion for the support, training, and education of the nation'smost creative and promising scientists. The Institute commitsalmost $700 million a year for research and distributes more than$80 million in grant support for science education. 更多请见： AVideo Introduction to HHMI /about/hr_movie/
384-well plate with small molecules
384池（小凹槽）渡上小分子
8Ｘ48＝384
图片出处：/productDetails.asp?prodID=130 /catalog.asp?section=product&groupID=52
图片出处： /Products/B uffers/MCS/mcs.html
Ｄrying Ｃhamber
时间：00：41 干燥室 相当于干燥剂，烘干机。或者下面的设备
Ｗashing Ｃhamber
时间00：50 清洗室 00：54洗完又干燥了一次
Sonicator工作原理
Micro Cleaning Solution at 1X concentration reduces surface tension and enhances cavitation（空洞现象） for superior microarray pin cleaning at the molecular（分子） and atomic （原子） levels. Acoustic waves (声波，箭头所示) formed by a sonic transducer（传感器） produce cavitation bubbles (red spheres) that deliver the cleaning force to pins and other types of microarray hardware.
Sonicator for Cleaning
Sonicator 4000 是世界上最先进的超声波破碎仪。 应用范围：
1.细胞破碎/裂解 2.抽提蛋白、核酸 3.修剪DNA/RNA 4.纳米技术研究 5.染色质免疫沉淀技术 6.样品均质、乳化 7.其它样品处理 （眼睛店帮你洗眼镜也用到） 时间00：33
48-pin printhead
定位00：29 针头排列（4Ｘ12）与我们获得图像的区块分布一样 一个针点一个22Ｘ22的斑点区？
A closeup of a microarray printer head, showing the detail of a microarray printing pin. /programs/as k/082406.html 图片出处： /stealth4bmicro spottingpinbubble145umfeatureswith06 ulbubbleuptake.aspx
Ｏthers
另一个牌子的点样机Ａrray it arrayit pointer.flv 无字幕有解说 slow printing.flv Microarray Printing
Printing microarrays at the UHN Microarray Centre （这个针头的速度慢了点， 但可以从近距离观察其工作细节。可惜没有文字说明）