微生物酶活性试验方法
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
2。
蛋白酶产生菌的分离与纯化2。
1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.2。
2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
2。
4 实验方法与步骤2。
4.1 分离1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
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2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
微生物的鉴定(精)
引言概述：微生物的鉴定是微生物学中的一个重要课题，它涉及到鉴定和分类微生物的种类、特性和功能等方面。
微生物的鉴定对于环境保护、农业生产、医学诊断等领域起着重要的作用。
本文将从微生物的分离培养、形态学特征、生理生化特性、分子生物学鉴定和抗生素敏感性等五个大点进行详细阐述微生物的鉴定方法和技术。
正文：一、微生物的分离培养1. 选择培养基：根据待鉴定微生物的特性，选择合适的培养基，如富含营养物质的寒天培养基、蔗糖琼脂培养基等。
2. 分离培养：采用传统的分离培养方法，如涂布法、稀释法等，将微生物分离为单个菌落。
3. 纯化培养：通过多次传代培养，并观察菌落形态和特性，将单菌落转移到新的培养基上，获得纯种微生物。
二、微生物的形态学特征1. 形态学观察：利用显微镜观察微生物的形态特征，如形状、大小、颜色、胞壁结构等。
2. 细胞结构分析：通过染色方法，观察微生物的细胞结构，如细胞壁、细胞膜、核质、细胞器等。
3. 胞内含物分析：利用染色剂或特定试剂，观察微生物胞内含物，如颗粒、颜色、气泡等。
三、微生物的生理生化特性1. 新陈代谢特性：通过培养微生物在不同营养条件下的生长情况观察其代谢特性，如需氧性、产酸性、产气性等。
2. 饮食特性：测定微生物对不同营养物质的利用情况，如碳源、氮源、矿物质等。
3. 酶活性分析：应用酶学方法检测微生物体内的酶活性，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
四、微生物的分子生物学鉴定1. 16S rRNA基因测序：提取微生物的基因组DNA，并进行PCR 扩增和测序分析，根据16S rRNA基因序列比对和构建系统发育树，进行物种鉴定。
2. 基因组学方法：通过全基因组测序和比较基因组学分析，探索微生物的基因组特征，如基因组大小、基因编码等。
3. 荧光原位杂交技术：利用具有特异性的探针标记微生物的特定序列，通过荧光显微镜观察微生物的存在和分布情况。
五、微生物的抗生素敏感性1. 抗生素敏感试验：采用纸片扩散法或高通量平板法，将不同浓度的抗生素施加在微生物生长培养板上，观察不同抗生素对微生物生长的影响。
酶的性质实验报告
酶的性质实验报告引言：酶是一类在生物催化过程中起关键作用的蛋白质。
它们能够降低活化能，促进化学反应的进行。
酶广泛存在于生物界，包括动物、植物和微生物体内。
本实验旨在通过多种试验方法，探究酶的性质及其在生物体内的功能。
一、酶的酸碱特性实验选取了两种酶：脂肪酶和淀粉酶。
首先，在不同的酸碱条件下，观察酶的活性变化。
将pH 2酸性溶液、pH 7中性溶液和pH 10碱性溶液分别与酶作用，随后加入相应的底物，如脂肪或淀粉。
通过观察底物的变化，可以确定酶在不同pH条件下的最适活性。
结果显示，脂肪酶在中性条件下活性最高，而淀粉酶在碱性条件下活性最高。
这表明，不同的酶对酸碱条件具有不同的适应性，从而揭示了酶的酸碱特性。
二、酶的温度特性实验选取了脂肪酶，通过在不同温度下检测酶的活性来研究其温度特性。
首先，在恒温培养箱中设置不同的温度，如30摄氏度、40摄氏度、50摄氏度等，并分别与脂肪酶作用，加入底物，观察底物的消耗情况。
实验结果显示，脂肪酶的最适活性温度大约在37摄氏度左右。
在低于最适温度时，酶的活性明显降低，而高于最适温度时，酶的活性也出现下降的趋势。
这说明酶对温度也表现出一定的敏感性，适温范围以内活性较高。
三、酶的底物选择性实验采用了几种常见的酶，如脂肪酶、蛋白酶和酸性磷酸酶，通过观察它们与不同底物的反应，研究了酶的底物选择性。
我们选取了脂肪、蛋白质和酸性磷酸盐作为底物，对不同酶进行测试。
结果显示，脂肪酶仅作用于脂肪底物，而对蛋白质和酸性磷酸盐则没有反应。
蛋白酶则只作用于蛋白质底物，而对其他底物无效。
而酸性磷酸酶则只对酸性磷酸盐有催化活性。
这一实验结果表明，不同的酶对底物具有特异性，即酶只能催化特定化学反应。
结论：通过这些实验，我们对酶的性质有了更深入的了解。
酶不仅具有酸碱特性，对温度也有一定的敏感性，并且会对特定底物发生催化反应。
这些特性使得酶在生物体内发挥着至关重要的作用。
进一步研究酶的性质和功能，有助于我们更好地理解生物体内各种化学反应的机制，并有可能为药物研发和生物工艺学的发展提供重要的指导。
微生物的测定方法
微生物的测定方法微生物的测定方法是科学研究者用来确定环境中或生物体内存在的微生物数量和种类的方法。
微生物包括细菌、真菌、病毒等微小的生物体，它们在生态、环境、医学等许多领域中具有重要的作用。
因此准确测定微生物的数量和种类对于研究和控制微生物相关问题具有重要意义。
测定微生物的方法可以分为直接方法和间接方法。
直接方法主要通过直接观察和统计小样本或全部微生物来获得结果，而间接方法则通过测定与微生物相关的物理、化学或生物学特征来推测其存在与数量。
直接方法包括：1. 显微镜观察：显微镜可以放大微生物的形态和结构，例如细菌的形态、真菌的菌丝和孢子等。
显微镜观察通常需要对样本进行染色，常用的染色方法有革兰氏染色、培养基染色、荧光染色等。
2. 细胞计数：细胞计数是一种直接测定微生物数量的方法，可以通过显微镜或自动计数器来进行。
这种方法适用于测定细菌、酵母等微生物的数量。
3. 培养方法：培养方法是一种将微生物转移到培养基上并培养出可见菌落的方法。
通过培养，可以对微生物进行纯化、鉴定和数量统计。
常用的培养基有琼脂培养基、肉汤培养基、大肠杆菌选择性培养基等。
4. 分子生物学方法：分子生物学方法是一种利用微生物的DNA或RNA序列信息进行测定的方法，包括聚合酶链反应（PCR）、DNA杂交、DNA测序等。
这些方法可以确定微生物的种类、亲缘关系和相对数量。
间接方法包括：1. 生化方法：通过测定微生物活动释放的代谢产物，如酶活性、产气能力、菌落形态等，来推测微生物的存在与数量。
例如，通过测定酸碱变化、色素生成和特定凝固酶的产生来检测特定菌株。
2. 分离方法：通过将微生物转移到特定培养基上，利用其特定生长需求来筛选和鉴定微生物。
例如，使用麦康凯琼脂和大肠杆菌选择性培养基来分离肠炎弧菌。
3. 抗体检测：利用特异性抗体与微生物抗原的特异性结合来进行测定。
例如，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）或荧光抗体方法来检测病毒或细菌的存在和数量。
微生物综合实验土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定
微生物综合实验：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定姓名:李青嵘班级:生工102学号:1014200044同组组员:黄得凤同组组员:张旭霞摘要本实验通过90?水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到两株纯培养的芽孢杆菌。
并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验，等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定，鉴定结果均为蜂房芽孢杆菌。
进一步通过3，5-二硝基水杨酸显色法对菌种的淀粉酶活力进行鉴定，测定结果分别为10.68MMU，12.64MMU。
关键词:淀粉酶，芽孢杆菌，酶活测定1. 前言淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。
目前淀粉酶广泛应用多种领域，在发酵工业中淀粉酶可用于淀粉原料的液化及糖化工艺;在食品工业中淀粉酶可用于面包焙烤，使其体积更大，颜色更好，颗粒更柔软;在农业中淀粉酶可作为饲料添加剂，降解饲料中淀粉营养成分以利于动物吸收利用;此外，淀粉酶在医疗卫生、废料处理、纺织印染等领域都有广泛应用。
目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中，尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。
其原因首先芽孢杆菌属(Bacillus)中能产生淀粉酶的菌种较多;其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值，如凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产的淀粉酶具有耐热性;再次，芽孢杆菌应用历史悠久，广泛用于饲料添加剂，其安全性有保证。
本文主要从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，从而获得有经济价值比较高的菌株。
2. 材料与方法2.1. 实验材料2.1.1. 土样的采集从广州大学B-8门前采集土样,g，每天加入2 g淀粉和10 ml水进行培养5天。
土壤学家的100个土壤测试方法
土壤学家的100个土壤测试方法土壤，作为生命的基础，对于人类的生存和发展有着不可替代的重要作用。
然而，随着人类活动的不断扩张和加剧，土壤遭受了极大的破坏和污染。
因此，能够对土壤进行科学和全面的检测和评估就显得尤为重要。
作为从事土壤研究的土壤学家，我们需要掌握一定的土壤测试方法来保证研究的准确性和科学性。
在这里，我将向大家介绍100个常用的土壤测试方法。
一、土壤理化性质的测试方法1. 粘土矿物分析法：利用X射线衍射仪或显微镜对土壤中的粘土矿物进行分析，以推断土壤的物理、化学和性质。
2. 土壤水分测定法：采用重量计法或滤纸试吸法测定土壤的干湿状态，以评估土壤的含水量。
3. 土壤容重测定法：利用容重试验器测定土壤的容重，以评估土壤的质地和密实度。
4. 土壤有机质含量测定法：采用加热酸化法或燃烧法测定土壤中的有机质含量。
5. 土壤pH测试法：通过pH试纸、pH计等工具测定土壤的酸碱度，以评估土壤的肥力和化学性质。
6. 土壤电导率测定法：利用电导仪等工具测定土壤的电导率，作为评估土壤盐碱度的重要指标。
7. 土壤粘粒含量测定法：利用湿筛法、液限试验等方法测定土壤中的粘粒含量，以评估土壤的质地和结构。
8. 土壤饱和状况测定法：采用气压浸泡法、蒸汽浸泡法等方法测定土壤的饱和状况，以评估土壤的水力学特性。
9. 土壤孔隙度测定法：利用质量法、容重法等方法测定土壤的孔隙度，以评估土壤的渗透性和通气性。
二、土壤微生物和生物学特性的测试方法10. 土壤微生物孔板数法：利用孔板法测定土壤中微生物的数量和种类分布，以评估土壤的生物量和多样性。
11. 土壤微生物活性测定法：利用蔗糖降解法、ATP酶法等方法测定土壤微生物活性的大小，以评估土壤的养分循环和生命活力。
12. 土壤酶活性测定法：利用过氧化氢酶法、联苯胺酶法等方法测定土壤中酶活性的大小，以评估土壤的生物化循环和正常性。
13. 土壤呼吸速率测定法：利用CO2通量和氧化还原电位等指标测定土壤的呼吸速率，以评估土壤的微生物代谢和活力。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或者塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）与0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱与水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱与溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳固，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳固后，570nm比色绘制标准曲线。
测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。
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微生物酶活性试验方法脱氢酶活性测定方法参考：【周春生, 尹军. 一脱氢酶活性检测方法的研究[J]. 环境科学学报, 1996, 4: 400-405.】以及【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】（一）试验方法：（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。
（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入7.5mlTris-HCl缓冲液（PH=8.4）、2.5ml硫酸钠溶液（0.36%）、2.5ml纯水以及2.5mlTTC溶液（0.4%）、混匀。
（3）样品培养：将比色管置于37℃条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min 后吸取5ml于离心管内，加0.5ml甲醛固定以作样品空白；（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合,于37℃条件下萃取TF10min后；（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差, 查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度, 即脱氢酶活性(mg/(L*h))（二）试剂：（1）0.4％三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；（2）Tris-HCl缓冲液：称取6.057gTris（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂），加入20ml 1mol/L HCl溶液, 再定容至1L；（3）硫酸钠溶液（0.36%）：3.6g硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4）TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。
（三）标准曲线的绘制：（1）采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、60、80、100、120、140µgTTC系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进行实验；（2）用8试管，分别加入2ml Tris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不加入TTC；（3）加入10g硫酸钠溶液，TTC被还原为红色的TF；（4）加入5ml丙酮振荡摇匀提取TF（振荡床振荡10次）；（5）离心5min后485nm下测吸光度；（6）吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。
（四）计算：TF=A*B*CA：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C分光时的稀释倍数，当分光>0,8时，稀释分光ATP含量测定方法参考：【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】ATP消化后变为无机磷，制备ATP消化液，测无机磷吸光度以确定ATP含量（一）试验方法：（1）活性污泥稀释1:20，曝气池稀释1:10（保证ATP量在0.1-1.0mg/L之间）；（2）用50ml烧杯加入35ml 的（pH=7.75 0.025M Tris缓冲液）加热至沸腾；然后加入待测活性污泥溶液1ml，煮沸加热30-60s后摇动几分钟放入冰浴中，冷却后加入pH7.75 0.025M的Tris缓冲液至50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测ATP；（3）ATP制备液消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（4）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；ATP含量高的污泥，微生物活性越高。
（二）试剂：（1）无机磷溶液中间液：烘干后称取0.2195g KH2PO4稀释至500ml容量品；（2）无机磷溶液使用液：上述溶液取10ml稀释至100ml；（3）定磷试剂：6mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸（体积比）=1：2:1:1，配置时按上述顺序加入试剂。
溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，若颜色不正常，则不能使用6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸加入83ml水中，得6mol/L；2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵→100ml容量瓶；10%抗坏血酸：取10g抗坏血酸→100ml容量瓶（棕色瓶冷藏）。
（4）ATP：10mgATP（5）pH7.75 0.025M的Tris缓冲液：3.02785g稀释至500ml+35ml 1mol/L 盐酸→1000ml容量瓶（6）10N硫酸：271.7ml浓硫酸加入700ml纯水中，冷却后，稀释至1000ml 容量瓶中；（三）标准曲线的绘制：1、无机磷标准曲线的绘制（1）取KH2PO4置于烘箱中恒重后称取0.2195g，稀释至500ml容量瓶中，得无机磷浓度100ug/L；（2）取10ml上述溶液稀释至100ml容量瓶中定容，得无机磷浓度10ug/L，取6之试管；试管无机磷纯水无机磷浓度加定磷试剂2 0.2 2.8 2 33 0.4 2.6 4 34 0.6 2.4 6 35 0.8 2.2 8 36 1.0 2.0 10 3 （3）将试管置于45℃中水浴，保温25min，冷却后660nm下比色；（4）以吸光度作为纵坐标，无机磷含量为横坐标，绘制标准曲线；2、ATP-无机磷曲线绘制；（1）称取10mgATP，取少量新配的pH7.75 0.025M的Tris缓冲液，充分摇匀溶解，定容至1L,最终浓度为10mg/L；取上清液，配置从1.00-0.01mg/L系列标准液；（2）ATP标准液的消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（3）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（4）以吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，绘制曲线；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，然后作为纵坐标，ATP为横坐标，绘制Pi-ATP相关曲线。
脲酶活性测定方法参考：【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法[M]. 科学出版社, 2008.】根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。
（一）试验方法：（1）水样预处理：取10ml待测样品经甲苯处理后，加5~10滴甲苯，盖好；（2）加试剂：15min后加10ml 10%尿素和20ml pH=6.7柠檬酸盐缓冲液（3）样品培养：将锥形瓶置于37℃条件下恒温箱，培养24h过滤；（4）继续加试剂：取滤液1-3mg/L（视样品浓度定）与50ml比色管中，加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀；（5）比色分析：20min后定容，并在578nm波长下分光；（6）计算：并在标准曲线上求氨氮的量，测出脲酶活性。
每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差？。
还需减去无土基质（尿素＋柠檬酸盐）。
（二）试剂：（1）甲苯（分析纯）；（2）10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中，（现配现用）；（3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2L；（4）苯酚钠溶液：A液：62.5苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。
B液.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。
将二溶液保存在冰箱里。
使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升；（5）次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。
（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。
（6）标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105℃烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。
（三）标准曲线的绘制：（1）将100ppm的标准溶液稀释为10ppm，分别吸取0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加蒸馏水至20ml；（2）再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min后显色，定容，使溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
（3）1h内在分光光度计上与波长578nm处比色，绘制标准曲线。
（四）计算：脲酶活性以24h内每克土中氨态氮的毫克数来表示。
NH3-N（mg/1g土24h）=（土样浓度×稀释倍数×比色体积）÷（1000×干土重）1000：1000为ug换算成mg土样浓度：标准曲线查得浓度硝酸还原酶活性测定方法参考：【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法[M]. 科学出版社, 2008.】原理：在厌氧条件下，通过样品与酚二磺酸的显色反应计算出反应前后硝态氮的含量差值，从而计算出硝酸还原酶的活性。
（一）试验方法：取10ml待测样品与50ml三角瓶中，加入葡萄糖，硝酸钾溶液，在真空下培养24h后，利用酚二磺酸分光光度计测定反应前后硝酸盐的含量差值，最后计算出硝酸还原酶活性（二）试剂：亚硝酸还原酶活性测定方法参考：【李振高, 骆永明, 滕应. 土壤与环境微生物研究法[M]. 科学出版社, 2008.】原理：通过亚硝态氮与格里试剂反应所产生的颜色深度，测定酶促反应前后亚硝态氮的变化，从而得出亚硝酸还原酶的活性。
（一）试验方法：取50ml待测样品与50ml三角瓶中，加入葡萄糖，亚硝酸钠溶液，在真空下培养24h后，加入格里试剂显色，最后再波长550nm处测定反应前后的样品吸光度值，其差值可表示亚硝酸还原酶活性硝化速率的测定方法硝化强度的试验方法（一）试验方法：（1）150ml三角瓶中盛30ml硝酸细菌培养基，灭菌；（2）培养：冷却，接种1ml活性污泥溶液，于28℃培养15天，取出过滤。
滤液装于塑料瓶中，低温保存（4度以下，最好马上测下步）。
用比色法测定虑液中的亚硝酸含量。
（3）加试剂：取滤液1ml（取决于虑液中亚硝酸量）于50ml容量瓶中，定容。