专题八第一讲基因工程和克隆技术课件
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基因工程与克隆技术.pptx
基因工程相关知识整合
概述基因工程和蛋白质工程基本操作过 程，并思考下列问题。 答案 基因工程基本操作过程：获取目的基因→构建 基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因 的检测与鉴定。 蛋白质工程基本操作过程：蛋白质预期功能→蛋白质 的三维结构 分子 氨基酸序列的多肽链 DNA合成
设计 基因（DNA）
（5）请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处：可以 克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍 。 关键信息 “酶”、“聚乙二醇”、“文字和箭头”、 “细胞壁” 知识依据 植物体细胞杂交 完整分析 （1）若去掉细胞壁而获得原生质体，需 用纤维素酶和果胶酶来处理。（2）用聚乙二醇处理 原生质体，可以诱导原生质体融合。（3）④⑤分别 为脱分化和再分化过程，能够形成一个完整植株， 体现出植物细胞的全能性。（4）可以通过质壁分离 与复原实验来鉴别原生质体是否再生出细胞壁。（5） 植物体细胞杂交最大好处在于可以克服远缘杂交不 亲和的障碍。
学案 基因工程与克隆技术
核心术语——(记准、写准、理解透，把握内涵和外延) 1.基因工程（限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体、 目的基因、基因表达载体、农杆菌转化法、显微注射法、 感受态细胞） 2.蛋白质工程（预期功能、分子设计、DNA合成） 3.植物细胞工程［植物组织培养（脱分化、再分 化、愈伤组织、丛芽）、植物体细胞杂交（原生体融合、 杂种细胞、杂种植株）］ 4.动物细胞工程［动物细胞培养（原代培养、传代培 养、细胞株、细胞系）、动物细胞核移植、动物细胞融 合（杂种细胞、单克隆抗体）］
（1）在培育转基因油料植物的过程中，基因操作需
要的工具酶是 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 。
在基因表达载体中，目的基因的首端必须含有 ，
它启是动子
识R别NA和聚结合合酶位点。
《基因工程》PPT教学 ppt课件
PPT课件
36
典型例子：抗烟草花叶病毒的转基因烟草、 抗病毒的转基因小麦、甜椒
PPT课件
37
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
3.抗逆转基因植物
PPT课件
38
4.利用转基因改良植物的品质
PPT课件
39
富含赖氨酸的转基因玉米
基转 因入 的荧 发光 荧素 光酶 烟蛋 草白
PPT课件 不会引起过敏的转基因大4豆0
原 理： 基因重组
表达水平： DNA分子水平
过程：
意义： 1、定向改造某些性状
2、克服远缘杂交
PPT课件
3
原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游
终止子
RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起 始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
将目的基因导入 农杆菌介导的遗传转化法
植物细胞
基因枪法
方法
将目的基因导入 动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入——感受态细胞吸收DNA分子
微生物细胞
(氯化钙法)
PPT课件
24
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①形态检测
检测— ②分子检测
PPT课件
25
非目的基因片段 GACATAGCTACA CTGTATCGATGT
PPT课件
1
我们主要讨论4个问题：
1. 什么是基因工程——基因工程的概念。
2. 为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。 3. 怎样进行基因工程——4大步骤 4. 基因工程的应用和前景
PPT课件
2
1、概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。
生物高频考点 基因工程与克隆技术.ppt
第 2 课时
基因工程与克隆技术
检测（二十八） “基因工程与克隆技术” 点击链接
考点一
基因工程与蛋白质工程
以文字信息或流程图等形式，综合考查基因工程与细胞工 程的原理、操作过程及应用是高考常考形式，题目难度稍大。 基因工程中限制酶和 DNA 连接酶的作用特点及在构建基因表达 载体中的应用 基 因 工 程 的 工 具 ， 应 具 备 的 基 本 条 件 有 ________________________(答出两点即可)， 而作为基因表达载 体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠 杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区 分 的 ， 其 原 因 是 _______________ ； 并 且 _______ 和 _______________的细胞也是不能区分的，其原因是 _________。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质 粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 ______________的固体培 养基。 (3)基因工程中， 某些噬菌体经改造后可以作为载体， 其 DNA 复 制所需的原料来自于 ________________。
3.(2016· 全国卷Ⅰ )某一质粒载体如图所示，外 源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的 基因失活(Amp r 表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr 表示四环素抗性基因 )。有人将此质粒载体用 BamHⅠ酶 切后，与用 BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。 结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆 菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有 插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
基因工程与克隆技术
检测（二十八） “基因工程与克隆技术” 点击链接
考点一
基因工程与蛋白质工程
以文字信息或流程图等形式，综合考查基因工程与细胞工 程的原理、操作过程及应用是高考常考形式，题目难度稍大。 基因工程中限制酶和 DNA 连接酶的作用特点及在构建基因表达 载体中的应用 基 因 工 程 的 工 具 ， 应 具 备 的 基 本 条 件 有 ________________________(答出两点即可)， 而作为基因表达载 体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠 杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区 分 的 ， 其 原 因 是 _______________ ； 并 且 _______ 和 _______________的细胞也是不能区分的，其原因是 _________。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质 粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 ______________的固体培 养基。 (3)基因工程中， 某些噬菌体经改造后可以作为载体， 其 DNA 复 制所需的原料来自于 ________________。
3.(2016· 全国卷Ⅰ )某一质粒载体如图所示，外 源 DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的 基因失活(Amp r 表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr 表示四环素抗性基因 )。有人将此质粒载体用 BamHⅠ酶 切后，与用 BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。 结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆 菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有 插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
目的基因克隆基因工程原理与技术刘志国课件ppt
PCR ● 增加了对不可培养微生物生理、生化和关键代谢机理的了解
DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同,
过程 （2）重组DNA分子导入受体细胞要方便。
以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增 目标DNA和载体浓度的确定 oligo（dT）-纤维素柱层析分离法 性，即形成可逆的瞬时通道，二ming recombination，RPR） 第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一
链
Strand ExchangeMutagenesis）
运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的单链
（正义引物） AGSP:基因特异引物
（反义引物）
盒式P CR原 理示 意图
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
第一节 PCR扩增法获得目的基因
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
方法 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否
已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易 高 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR )
反向PCR 以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增
第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA；
TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团
设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接
DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同,
过程 （2）重组DNA分子导入受体细胞要方便。
以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增 目标DNA和载体浓度的确定 oligo（dT）-纤维素柱层析分离法 性，即形成可逆的瞬时通道，二ming recombination，RPR） 第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一
链
Strand ExchangeMutagenesis）
运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的单链
（正义引物） AGSP:基因特异引物
（反义引物）
盒式P CR原 理示 意图
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
第一节 PCR扩增法获得目的基因
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
方法 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否
已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易 高 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR )
反向PCR 以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增
第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA；
TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团
设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接
基因工程-课件ppt
(7)用于载体的质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶识别位点(√ )
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在
并表达
(√)
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
2．载体需具备的条件及其作用(连线)
对点落实
返回
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了
EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列
与 切 割 位 点 ， 图 (b) 为 某 种 表 达 载 体 的 示 意 图 ( 载 体 上 的
EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓
↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
返回
(2)写出产生的末端的种类：①产生的是黏性末端；②产生的 是 平末端 。 (3)EcoRⅠ限制酶和 SmaⅠ限制酶识别的碱基序列 不同，切割 位点不同 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性 。
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
图(b)
图(c)
(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的
有__E_·_c_o_l_i__D_NA_连__接__酶_和____T_4D_N_A_连___接__酶___，其中既能连接黏 性末端又能连接平末端的是__T_4D_N_A__连__接__酶___。
解析
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
基因工程-PPT课件
干扰素 1200 升人血 2－3 万美元 / 病人
1 升发酵液 200－300 美元 / 病人
国外生物医药的发展
➢1976年第一家基因工程技术开发药物的公司建立。 ➢1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素正式生产，推向市场。 ➢2019年全球生物技术公司总数已达4284家，美国占34％。 ➢2019年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元。 ➢2019年市场上的生物技术药物达到200种左右，而在研的药物为600种。 ➢全世界已有2.5亿人使用生物技术药物和疫苗。
• 曼哈顿计划 • 阿波罗计划
20世纪科学史上3个里程碑
HGP的意义
• 了解生命的起源与进化 – 认识种属之间和个体之间存在差异的起因 – 五种“模式生物” 基因组的研究：大肠杆菌、酵母、 线虫、果蝇和小鼠
• 解码生命，认识自身 – 了解生命体生长发育的规律
• 认识疾病产生的机制，掌握生老病死规律 – 疾病的诊断和治疗
甜椒在栽培的过 程中，容易受病毒的 感染。我国科学工作 者，采用转基因技术， 培育出抗病毒的甜椒。
油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜 籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育 出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且 油的纯度质量更好。
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以 用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称 它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好， 产量更高。
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状
遗传缺陷病人
腺病毒 adenovirus
修正基因
插入修正基因
感染病人細胞
取出病人細胞
修正基因转入到患者体内
注射修正基因
《基因工程专题》课件
通过基因工程改造细胞和微生物，可 以用于药物生产、疾病治疗和疫苗研 发，提高治疗效果和降低成本。
人类社会面临的挑战和机遇
伦理和安全问题
基因工程技术的发展和应用涉及到伦理和安全问题，如基因编辑 技术的滥用、基因歧视和生态风险等。
法律和监管问题
随着基因工程技术的广泛应用，相关的法律和监管体系需要进行调 整和完善，以确保技术的合理应用和发展。
04
基因工程的伦理和社会问题
基因工程的伦理问题
基因工程的道德地位
基因工程涉及到对生命本质的干预，因此引发了关于其道 德地位的讨论。一些人认为这是对自然的一种干预，而另 一些人则认为这是科技进步的必然结果。
基因歧视
由于基因信息可能揭示个人健康、行为等方面的信息，因 此存在基因歧视的风险。这可能导致保险、就业等方面的 歧视。
03
基因工程的应用实例
农业基因工程
抗虫作物
通过基因工程技术，将抗虫基 因导入作物，使其具有抗虫能
力，减少农药使用。
抗病作物
通过基因工程技术，增强作物 的抗病能力，降低作物病害的 发生率。
高产作物
通过基因工程技术，提高作物 的产量和品质，满足不断增长 的食物需求。
转基因动物
通过基因工程技术，培育出具 有优良性状的转基因动物，如
基因工程专
contents
目录
• 基因工程概述 • 基因工程的基本技术 • 基因工程的应用实例 • 基因工程的伦理和社会问题 • 未来展望
01
基因工程概述
基因工程概述
基因工程是指通过人工操作对 生物体的基因进行修饰、改造 和重组的技术。
它利用现代分子生物学技术， 在分子水平上对基因进行操作 ，从而实现对生物性状的改变 。
高考生物二轮复习：5.1《 基因工程与克隆技术》ppt课件
解析：该基因的表达产物多肽 P1 的抗菌性和溶血性均很强， 要研发出抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先应根据 P1 的 氨基酸序列设计模拟肽，再构建相应的 DNA 片段。 答案:C
(4)若在转 htPA 基因母羊的羊乳中检测到________，说明目的基因 成功表达。
生物
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第1讲 基因工程与克隆技术
结束
解析：(1)将目的基因和载体用同一种限制酶切割后能产生相同的黏 性末端，便于构成表达载体。检测目的基因是否成功插入的技术为 DNA 分子杂交技术。(2)利用促性腺激素可促进母羊超数排卵。采 集的精子必须利用获能液处理使其获能后才具备受精能力。(3)将重 组表达载体导入动物受精卵的常用方法是显微注射法。为了获得母 羊，需对胚胎进行性别鉴定，性染色体组成为 XX 类型才能发育为 母羊。利用胚胎分割和移植技术可获得多个个体，体现了早期胚胎 细胞可发育成个体的全能性。(4)基因成功表达的标志是产生了相应 的蛋白质，因此 htPA 基因成功表达的标志是在转基因母羊的羊乳 中检测到 htPA(或人组织纤溶酶原激活物)。
答案:D
生物
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第1讲 基因工程与克隆技术
结束
2．(2014· 山东高考)人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药 用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：
生物
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第1讲 基因工程与克隆技术
结束
(1)htPA 基因与载体用________切割后，通过 DNA 连接酶连接， 以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞 DNA， 可采用________技术。
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本 DNA 连接酶构建的表达载体中仍存在限制酶Ⅱ的识别位点；
讲 栏
用限制酶Ⅱ切割后，编码控制细胞分裂素合成的物质就不能合
目 开
成了。
关
答案 D
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网络构建·自我诊断
第1讲
2.家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导 入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
高频考点·命题示例
第1讲
必考点 1 基因工程 1.对基因工程基本工具的思考 本 (1)限制酶、DNA 连接酶、载体的化学本质一样吗？
讲
栏 答案 不一样。限制酶和 DNA 连接酶的化学本质是蛋白质，
目
开 载体的化学本质是核酸。
关
(2)限制酶和解旋酶有怎样的区别？
答案 限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条 链中特定的位置断开；而解旋酶是将 DNA 的两条链间的氢 键断开，从而形成两条单链。
第1讲
[自我诊断]
1.质粒是常用的基因工程载体。如图是某种天然土壤农杆菌 Ti
质粒结构示意图(标示了部分基因及部分限制酶作用位点)，据
图分析下列说法正确的是
本 讲 栏 目 开 关
()
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网络构建·自我诊断
第1讲
A.图中的终止子是由三个相邻碱基组成的终止密码
B.用农杆菌转化法可将该质粒构建的表达载体导入动物细胞
本
讲 C.用限制酶Ⅰ和 DNA 连接酶改造后的质粒无法被限制酶Ⅱ
栏
目
切割
开
关 D.用限制酶Ⅱ处理能防止该质粒构建的表达载体引起植物
疯长
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网络构建·自我诊断
第1讲
解析 密码子是 mRNA 上三个相邻的碱基，不会出现在 DNA
上；农杆菌转化法是将重组载体导入植物细胞；用限制酶Ⅰ和
(1)进行转基因操作前，需用________酶短时间处理幼蚕组 织，以便获得单个细胞。
本
讲 (2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自
栏
目 cDNA 文 库 的 干 扰 素 基 因 片 段 正 确 插 入 表 达 载 体 的
开
关 ________和________之间。 (3)采用 PCR 技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细 胞。该 PCR 反应体系的主要成分应包括：扩增缓冲液(含 Mg2 ＋ ) 、 水 、 4 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 、 模 板 DNA 、 ____________________________和____________。
关 酶切割位点；③具有特殊的标记基因。
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高频考点·命题示例
第1讲
2.对基因工程基本操作程序的思考
(1)目的基因的获取途径 ① 直接分人工合成目的基因
栏
目 开
常用方法有：a.化学合成法：已知核苷酸序列的 较小 基因，
提示 基因工程、植物组织培养。
2.基因工程和克隆技术涉及哪些工具酶？
本
讲 提示 基因工程的工具酶是限制酶和 DNA 连接酶，克隆技术
栏
目 的工具酶是纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶。
开 关
3.转基因动物的培育涉及到哪些生物工程？
提示 基因工程、动物细胞工程、胚胎移植。
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网络构建·自我诊断
本 讲 栏 目 开 关
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第1讲
第 1 讲 基因工程和克隆技术
本 [明确考纲要求] 1.基因工程：(1)基因工程的诞生(Ⅰ)。(2)基
讲 栏
因工程的原理及技术(Ⅱ)。(3)基因工程的应用(Ⅱ)。(4)蛋白质
目 开
工程(Ⅰ)。2.克隆技术：(1)植物的组织培养(Ⅱ)。(2)动物的细
关 胞培养与体细胞克隆(Ⅰ)。(3)细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)。
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网络构建·自我诊断
[关键处填充]
本 讲 栏 目 开 关
第1讲
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网络构建·自我诊断
第1讲
限制酶 载体
基因表达载体的构建
本
讲
栏 目的基因的检测与鉴定
目
开 关
转基因动物
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网络构建·自我诊断
第1讲
(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生
接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这
样可以____________________________，增加培养的细胞数
量，也有利于空气交换。
本 讲
解析
(1)为了将动物组织分散并得到单个细胞，可以用胰蛋
基因治疗
基因
可产生自然界没有的蛋白质
细胞的全能性、细胞膜的流动性
植物体细胞杂交 培育作物新品种
细胞增殖 动物细胞核的全能性 获得克隆动物个体 细胞膜流动性
给小鼠注射抗原 产生专一抗体的杂交瘤细胞
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网络构建·自我诊断
第1讲
[连接处思考]
1.转基因植物的培育涉及到哪些生物工程？
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高频考点·命题示例
第1讲
(3)DNA 连接酶和 DNA 聚合酶有怎样的区别？
答案 DNA 连接酶连接两个 DNA 片段，而 DNA 聚合酶只能
本 将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
讲 栏
(4)载体具有哪些条件？
目 开
答案
①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；②有多个限制
发生接触抑制现象而放入小玻璃珠可以增加细胞贴壁生长的
附着面积，同时珠内专中题八空第，一讲有基课因利件工于程和空克隆气技术交换。
网络构建·自我诊断
答案 (1)胰蛋白(或胶原蛋白)
(2)启动子 终止子
本 讲
(3)引物 Taq DNA 聚合酶
栏 目
(4)扩大细胞贴壁生长的附着面积
开
关
第1讲
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
栏 目
白(或胶原蛋白)酶处理动物细胞。(2)在基因工程中，构建表达
开 关
载体时，需要将目的基因插入启动子和终止子之间，以使目的
基因得到高效表达。(3)PCR 过程模拟的是细胞内 DNA 分子的
复制过程，需要模板、原料、能量、酶(DNA 聚合酶)、适宜的
温度和酸碱度等，同时需要加入设计好的引物。(4)为了防止
关 直接利用 DNA合成仪 用化学方法合成，不需要模板。
b.人工合成法：以 RNA 为模板，在 逆转录酶 作用下人工
合成。
c.利用 PCR 技术获得。
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高频哪几步用到了限制酶，又有哪