双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究

关键词：木瓜蛋白酶；双水相萃取；酶活收率
中图分类号：TQ925.+2
文献标志码：A
doi：10.3969/jissn.1671- 9646(X).2010.10.020
Purification of Papain by Aqueous Two- phase Extraction
Cao Duixi, Du Zheng, Han Yuting, Yu Liping, Liu Kunxun, Chen Yuying, *Duan Shan (College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China) Abstract: Papain is extracted by aqueous two phase system consisting of polyethylene glycol (PEG)/ ammonium sulfate (NH4)2SO4). By comparing with the activity of crude papain, it is found that the composition of the system has little effect on the protease activity, the PEG/(NH4)2SO4 system is established for the extraction of papain. The influences of PEG molecular weight, PEG concentration, (NH4)2SO4 concentration, pH value and the dosage of crude papain on the extraction are further investigated. The results show that with the aqueous two phase system consisting of 22.0% PEG6 000, 14.6% (NH4)2SO4, at pH 5.0 and 7.5% crude papain is added, 89.30% protease activity is recovered with 2.02 fold purification and the specific activity is 3 639 U/ mL. Key words: papain; aqueous two- phase extraction; recovery of protease activity
番木瓜汁经转速 4 000 r/min，离心 15 min，除 杂，即为粗木瓜蛋白粗酶液。 1.2.2 蛋白质含量测定
以 牛 血 清 白 蛋 白 为 标 准 蛋 白 ， 采 用 GB／T 5009.5—2003，凯氏定氮法标定牛血清白蛋白。蛋白
收稿日期：2010- 06- 10 作者简介：曹对喜 （1987- ），女，广东人，在读本科，研究方向：食品科学。
(NH4)2SO4 质量分数、pH 值以及粗酶添加量对木瓜蛋白酶萃取的影响，结果表明，在 PEG （分子量 6 000） 质量分数
为 22.0%，(NH4)2SO4 为 14.6%，pH 值为 5.0，粗酶添加量为 7.5%所组成的双水相体系下，可获得酶活收率 89.30%，
纯化倍数 2.02，提取的木瓜蛋白酶比酶活达到 3 639 U/mL。
（1） PEG 分子量对酶活性的影响。配制质量分数 为 20％的不同分子量的 PEG （400，2 000，4 000， 6 000） 溶液，加入一定量的酶液，静置 10 min，测定
表 2 P EG （分子量 6 000） 质量分数对酶活性的影响
PEG 质量分数 /%
酶活收率 /%
10
95.0
15
目前关于木瓜蛋白酶的分离纯化方法大多局限于 实验室研究，纯化工艺复杂，步骤繁琐，多步分离纯 化虽可得到较高酶活，但得率低，不适用于工业规模 化生产[1-5]。双水相萃取 （aqueous two- phase systems， ATPS） 与水—有机相萃取的原理相似，都是依据物 质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同 时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作 用和各种力 （如憎水键、氢键和离子键等） 的存在和 环境因素的影响，使其在上、下相中的质量分数不 同。双水相萃取技术用于生物活性物质 （如酶） 分离 提纯，具有操作步骤少，操作条件温和，过程易于放 大，不存在有机溶剂残留等众多优点[6]，更重要的是 双水相萃取避免了传统液—液萃取中生物活性物质与 有机溶剂的直接接触，保护了其活性，因此该技术广 泛应用于生物活性物质的分离提纯[7]。本项目以未成 熟的番木瓜乳汁为原料，经过简单的预处理，采用 PEG/(NH4)2SO4 双水相体系进行萃取，确定木瓜蛋白
农产品加工·学刊
第 10 期(总第 223 期) 2010 年 10 月
农产品加工·学刊 Academic Periodical of Farm Products Processing
文章编号：1671- 9646 ( 2010 ) 10- 0066- 04
2010 年第 10 期
No.10 Oct.
0.72
0.65
0.62
PEG （分子量 6 000） 质量分数对酶活性的影响见 分配系数 Ke
0.09
0.34
1.83
表 2，(NH4)2SO4 质量分数对酶活性的影响见表 3。
酶活收率 Y /%
5.8
18.1
53.1
从表 1 可以看出，PEG 分子量对酶的活性影响 纯化倍数 / 倍
0.53
1.33
表 1 P EG 分子量对木瓜蛋白酶活性的影响
PEG 分子量
酶活收率 /%
管中，在 37 ℃水浴中保温 8 min，吸取预热 37 ℃酪
400
95.0
蛋白液 （质量分数为 8%） 1.5 mL 加入此管，在 37 ℃
2 000
96.2
水浴中反应 10 min，加入三氯乙酸 （TCA） 1.5 mL 摇
双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究
曹对喜，杜 征，韩玉婷，余丽萍，刘坤逊，陈玉莹，* 段 杉
（华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642）
摘要：采用聚乙二醇 （PEG） / 硫酸铵 （(NH4)2SO）4 双水相体系对木瓜蛋白酶进行提取。通过与粗酶酶活比较，成相 组分对酶活性影响不大，因此建立 PEG/(NH4)2SO4 体系提取木瓜蛋白酶。探讨了 PEG 分子量、PEG 质量分数 、
×100%；
纯化倍数 = 上相比酶活 。 粗酶比酶活
(NH4)2SO4 质量分数 /%
10 15 20 25 30
酶活收率 /%
90.4 89.1 88.4 89.0 86.4
分析，双水相萃取法提取木瓜蛋白酶是可行的，而且 使木瓜蛋白酶分配在上相 （PEG 相） 更有利于酶的 保活。 2.2 双水相萃取对纯化效果的影响 2.2.1 PEG 分子量对木瓜蛋白酶纯化效果的影响
10%~35%的 PEG （分子量 6 000），加入一定量的酶
液，静置 10 min，测定酶活，并与粗酶酶活相比较。
（3） (NH4)2SO4 质量分数对酶活性的影响。配制质 量分数 10%~35%的(NH4)2SO4 溶液，加入一定量的酶 液，静置 10 min，测定酶活，并与粗酶酶活相比较。
1.2.5 双水相萃取试验
项目
1
2
3
2 结果与分析
粗酶添加量 /% PEG 分子量
2.5 2 000
2.5 4 000
2.5 6 000
2.1 成相组分对酶活性的影响
PEG 质量分数 /%
14.6
14.6
14.6
(NH4)2SO4 质量分数 /% 14.6
14.6
14.6
PEG 分子量对木瓜 蛋 白 酶 活 性 的 影 响 见 表 1， 相体积比 R
4 000
93.4
6 000
94.1
匀，静置 20 min；另取样液 （已激活） 0.3 mL 置另
一带塞试管中，加入 TCA 1.5 mL，37 ℃保温 10 min 后 ， 加 入 预 热 至 37 ℃ 的 酪 蛋 白 液 1.5 mL， 静 置 20 min。以蒸馏水为对照，测 2 个管的 A275 nm 值，同 时做 2 个平行试验。 1.2.4 成相组分对酶活性的影响
固定体系总质量为 20.5 g，向其中分别加入一定质
量分数的 PEG 溶液和(NH4)2SO4 溶液，在一定 pH 值下， 室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积
比 R，分别测定上、下相的酶活力和蛋白质质量分数。
R=
上相体积 下相体积
；
酶分配系数
Ke=
上相酶活 下相酶活
；
酶活收率
Y=R×
Ke 1+R×Ke
* 为通讯作者：段 杉 （1966- ），男，副教授，博士，研究方向：食品化学。E- mail：duanshan01@。
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2010 年第 10 期
曹对喜，等：双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究
·67·
质含量测定采用考马斯亮蓝 G- 250 法。 1.2.3 酶活力测定
量取酶液 0.3 mL，加入激活剂 0.25 mL 于带塞试
94.6
20
95.1
25
93.5
30
90.1
35
88.4
酶活，并与粗酶酶活相比较。 （2） PEG （分子量 6 000） 质量分数对酶活性的影
表 3 (NH4)2S O4 质量分数对酶活性的影响