核酸提取和注意事项
核酸采集保存知识点总结
核酸采集保存知识点总结一、核酸采集的操作流程核酸采集的操作流程包括样本采集、核酸提取和保存三个主要步骤。
下面将对这三个步骤分别进行介绍。
1. 样本采集在进行核酸采集时，首先需要采集样本，常见的样本包括血液、唾液、鼻拭子、咽拭子、组织等。
在采集样本时，需要注意以下几点：(1) 样本采集前，需要严格遵循无菌操作，使用无菌手套，并保持工作区域的清洁。
(2) 样本采集时，要选择合适的采集器具，不同样本可选择不同的采集器具，比如血液可以选择采血管、鼻拭子可以选择鼻拭子采集器等。
(3) 样本采集后，应尽快进行保护性包装，避免样本受到外界污染。
(4) 不同样本的采集方法有所不同，比如采集血液时要用无菌注射器采集，采集鼻拭子时要注意插入深度和旋转操作等。
2. 核酸提取核酸提取是指从采集的样本中分离出核酸的过程。
常见的核酸提取方法包括化学法、机械法和离心法等。
在进行核酸提取时，需要注意以下几点：(1) 核酸提取试剂的选择要根据样本类型和需要的核酸纯度进行选择，比如采集全血样本时可选择通用的核酸提取试剂盒，采集唾液时可选择适用于唾液样本的提取试剂等。
(2) 核酸提取过程中，需要严格按照试剂盒说明书中的操作方法进行，不同的试剂盒可能有不同的提取步骤和操作要点。
(3) 核酸提取后，需要对提取得到的核酸进行保存，以便后续的分子生物学实验或临床诊断检测。
3. 样本保存样本保存是核酸采集过程中的关键环节，它直接关系到后续实验结果的准确性和稳定性。
常见的样本保存方法有干冰保存、-80°C冷冻保存和室温保存等。
以下是几种常见的样本保存方法及其注意事项：(1) 干冰保存干冰保存是一种常见的样本保存方法，它可以在短时间内将样本冷冻到极低温度，有利于核酸的保存。
在进行样本保存时，需要注意以下几点：- 样本保存前，应将核酸溶液均匀混合，并分装到干冰盒中。
- 样本保存后，需将干冰盒放置在干冰箱中，并保持在-70°C～-80°C的温度范围内。
核酸提取步骤及注意事项
核酸提取步骤及注意事项---摘要核酸提取是生物学实验中常见的重要步骤，用于从样本中纯化和获得核酸。
本文将介绍核酸提取的基本步骤，并指出一些需要注意的事项。
---1. 核酸提取的基本步骤1. 样品准备：选择合适的样品进行核酸提取，如细胞、组织、血液等。
样品应保存在适当的条件下，以保持其完整性和稳定性。
在提取过程中，应保持样品的纯净度，避免污染和降解。
2. 细胞破碎：使用适当的方法破碎细胞膜，如机械破碎、化学溶解、超声波破碎等。
破碎时应注意温度控制、避免核酸降解，以及避免悬浮液的污染。
3. 溶解和脱脂：加入适量的溶解缓冲液和脱脂试剂，使核酸从其他杂质中分离。
溶解和脱脂过程应遵循规定的条件和比例，确保高效分离和纯化。
4. 酶解和消化：添加酶解缓冲液和酶解试剂，以去除蛋白质、RNA等杂质。
在酶解和消化过程中，应注意适当的时间和温度，以避免核酸的降解和损失。
5. 提取和纯化：通过离心、过滤、凝胶电泳等方法，将核酸从溶液中分离出来。
提取和纯化过程中，应注意操作的规范和准确性，以确保获得高质量的核酸。
6. 纯化和检测：使用柱层析、电泳、分光光度计等方法，对提取的核酸进行纯化和检测。
纯化和检测过程中，应遵循操作规程，进行准确的数据记录和结果分析。
---2. 注意事项1. 工作区域：核酸提取应在干净的实验室环境中进行，避免外界污染和其他干扰因素的干扰。
实验室应定期进行消毒和清洁，并保持适当的温度和湿度。
2. 工具和试剂：使用高质量的工具和试剂，避免因质量差的材料而导致实验出现问题。
试剂的保存条件和有效期限应按照说明书要求进行，避免使用已过期或变质的试剂。
3. 操作规范：在核酸提取过程中，应根据标准操作规程进行操作，严格遵守实验室安全和操作规范。
严禁接触裸露的皮肤、吸入有害气体，必要时应佩戴个人防护装备。
4. 试剂交叉污染：为避免试剂交叉污染，应使用干净的工具，确保每个步骤使用新的试剂和材料。
严禁在不同实验或样品中混用相同的工具，以避免导致污染和误差。
核酸提取原理及方法
核酸提取原理及方法核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从细胞或组织中分离出核酸并净化的过程。
核酸提取的成功与否直接影响到后续的实验结果，因此掌握核酸提取的原理和方法对于科研工作者来说至关重要。
一、核酸提取原理。
核酸提取的原理主要包括细胞破碎、核酸溶解和净化三个步骤。
首先，细胞膜和细胞壁需要被破坏，以释放细胞内的核酸。
其次，核酸需要被有效地溶解，使其能够被提取出来。
最后，通过净化步骤去除蛋白质、多糖和其他杂质，从而得到纯净的核酸样品。
二、核酸提取方法。
1. 酚氯仿法。
酚氯仿法是最常用的核酸提取方法之一。
其原理是利用酚和氯仿两种有机溶剂与水相不相溶的特性，将细胞裂解液中的蛋白质等杂质分离出去，从而得到纯净的核酸。
这种方法操作简单，适用于提取大量样品。
2. 硅胶柱法。
硅胶柱法利用硅胶膜对核酸的亲和力进行提取和分离。
通过将样品加入硅胶柱后，核酸能够与硅胶膜结合，而其他杂质则被洗脱掉。
这种方法提取的核酸纯度高，适用于对纯度要求较高的实验。
3. 磁珠法。
磁珠法是近年来发展起来的一种核酸提取新方法。
通过在磁珠表面修饰亲核酸的功能基团，使得核酸能够与磁珠结合。
利用磁场的作用，可以将核酸与磁珠分离出来，从而实现核酸的提取和纯化。
这种方法操作简便，且适用于高通量提取。
三、注意事项。
在进行核酸提取时，需要注意以下几点：1. 样品的质量和保存对提取结果有重要影响，因此在提取前需要确保样品的完整性和纯度；2. 根据不同的实验目的和样品特点选择合适的提取方法，以确保提取效果；3. 在操作过程中要注意无菌操作，避免外源性核酸的污染；4. 核酸提取后，应根据实验需求储存或立即进行下一步实验。
总结，核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，掌握核酸提取的原理和方法对于科研工作者来说至关重要。
不同的提取方法有着各自的特点和适用范围，选择合适的提取方法能够提高实验效率和结果的准确性。
在实验操作中要严格按照操作规程进行，确保提取的核酸样品质量和纯度。
核酸采集操作流程及注意事项
核酸采集操作流程及注意事项核酸采集是一种常用的生物样本采集方法，用于检测病原体的遗传物质。
以下是核酸采集的一般操作流程和注意事项：操作流程：1.准备工作：●确保工作区域整洁、干净，并做好个人防护，包括佩戴口罩、手套和实验室外套。
●检查所需的采集工具和试剂是否完整和有效，如采集管、标签、采集液等。
2.样本采集：●向患者解释采集过程，提供必要的指导和支持。
●根据具体采集部位，选择合适的采集工具，如棉签、拭子等。
●注意遵循正确的采集方法，确保从患者体内采集到足够的样本。
●采集后将样本放入采集管中，确保管盖紧闭，并在管上标明患者信息和采集日期。
3.样本处理：●根据采集管上的要求，添加适当的保存液（如稳定剂）。
●严格按照操作规程将样本进行处理和保存，以确保遗传物质的稳定性和完整性。
●注意避免污染和交叉污染，避免与其他样本接触。
4.清洁和废弃物处理：●在采集完毕后，及时清洁工作区域和使用的工具。
将废弃物按照生物危险废弃物的处理要求进行处置。
注意事项：1.严格遵守无菌操作：采集前和采集过程中，保持工作区域和工具的无菌状态，以避免样本污染。
2.避免交叉污染：每个患者使用一次性的采集工具和采集管，避免不同患者样本之间的交叉污染。
3.注意采集部位的选择和操作：根据具体的检测需求和采集部位的不同，选择合适的采集工具和方法，并按照正确的操作步骤进行采集。
4.安全防护：佩戴口罩、手套和实验室外套等个人防护用品，避免直接接触样本和可能存在的病原体。
5.样本标识和记录：在采集管上准确标注患者信息和采集日期，确保样本的追踪和记录。
6.操作规范和培训：操作人员应熟悉和遵守相关的操作规程，并接受相关培训，以确保采集的准确性和可靠性。
7.废弃物处理：将废弃物按照规定的生物危险废弃物处理程序进行处置，避免对环境和他人造成风险。
总之，严格的操作流程和注意事项是确保核酸采集的准确性和可靠性的重要保证，同时保护操作人员和环境的安全。
在实施核酸采集时，应根据具体的要求和规定进行操作，并遵循实验室的标准操作程序。
核酸检测需要那些注意事项
核酸检测需要那些注意事项核酸检测是一种用于检测病原体核酸的方法，主要用于检测病原体感染、传染病的早期诊断和流行病学调查。
在使用核酸检测技术进行检测时，需要注意以下几个方面：1. 样本的采集：核酸检测需要采集患者的体液或组织样本，如鼻咽拭子、口咽拭子、血液、尿液等。
在采集样本时，应遵循严格的无菌操作，并确保采集到的样本能够保持完整性和纯净度。
另外，采集过程中应注意预防交叉感染，使用一次性的采样器具，并避免接触其他污染源。
2. 样本的保存与运输：采集到的样本需要及时进行存储和运输，以确保核酸的完整性。
一般来说，样本应尽快送达实验室进行处理，但在送达之前，可以暂时将样本保存在2-8摄氏度的冰箱中，避免冰冻和高温。
在运输过程中，可以使用冷藏箱、冷链运输等方式来保持样本的稳定性。
3. 实验室条件：核酸检测需要在实验室环境下进行，因此实验室应具备相应的设施和设备。
实验室应保持洁净，避免有害物质的污染。
同时，实验室应配备相应的核酸提取、扩增和检测设备，如纯化试剂、PCR仪、电泳设备等。
实验室人员应具备相关的专业知识和技能，并按照标准操作程序进行实验。
4. 样本的预处理和核酸提取：在进行核酸检测之前，需要对样本进行必要的预处理和核酸提取。
预处理包括样本的离心、离析、悬浮等步骤，以裂解细胞和释放核酸。
核酸提取是将核酸从样本中纯化出来的过程，常用的方法有有机溶剂法、硅胶膜法、磁珠法等。
在预处理和核酸提取的过程中，应注意避免交叉污染，并使用无脂的试剂和无RNase 的器具。
5. PCR扩增和检测：核酸检测常用的方法是聚合酶链式反应（PCR），通过PCR可以扩增出足够数量的目标核酸序列，然后使用凝胶电泳或荧光PCR等方法进行检测。
在PCR扩增和检测的过程中，应注意以下几点：首先，要保证反应体系的准确性和稳定性，使用新鲜的试剂和标准品；其次，要正确设置PCR反应条件，包括反应体系的组成、温度和时间等参数；最后，要进行结果解读和数据分析，根据阈值循环数（Ct值）判断样本是否阳性或阴性。
核酸提取流程及注意事项
核酸提取流程及注意事项本文档将介绍核酸提取的基本流程以及需要注意的事项。
1. 核酸提取流程1. 准备样本：使用适当的方法采集样本，并将其放入离心管或样本收集器中。
2. 细胞破碎：使用细胞破碎缓冲液将样本离心管/样本收集器中的细胞破碎。
3. 核酸溶解：将细胞破碎液转移到离心管中，并加入核酸溶解液。
充分混合并孵育一定时间。
4. 蛋白质沉淀：加入蛋白质沉淀剂，使蛋白质沉淀形成。
离心样本以去除蛋白质沉淀。
5. 取出上清液：小心地将上清液完全转移到新的离心管中，并避免带入任何沉淀。
6. 酒精沉淀：加入适量冷酒精，使核酸沉淀形成。
离心样本以沉淀核酸。
7. 洗涤：去除酒精，使用70％乙醇洗涤核酸沉淀，以去除杂质。
8. 干燥：离心样本以去除乙醇，并将核酸沉淀在室温下干燥。
9. 溶解：使用核酸溶液溶解核酸沉淀，以获得最终的核酸提取物。
2. 注意事项- 操作前确保实验室中的工作区域及设备已经彻底清洁，并且消毒所需器材。
- 严格按照实验室的安全操作规程进行操作，佩戴个人防护装备，如手套和口罩。
- 确保使用的试剂及其浓度、质量得到了验证，并按照提取试剂的指导书进行操作。
- 注意避免样本污染，避免核酸降解和污染的情况发生。
在操作过程中尽量避免直接接触皮肤，使用滤液器等器具进行操作。
- 样本处理过程中，尽量减少离心速度和时间，以避免影响核酸的质量。
- 核酸提取中的步骤应在恒温的环境下进行，避免温度变化对结果的影响。
- 在每个步骤结束后，及时标记和记录样本信息，减少错误。
- 技术操作前后，仔细清洗所有的设备和工作台，避免交叉污染。
以上是核酸提取的基本流程及注意事项，希望对您有所帮助。
如有问题，请随时咨询。
核酸提取流程及注意事项
核酸提取流程及注意事项1. 简介核酸提取是从生物样本中分离纯化核酸的过程，是进行分子生物学和基因组学研究的重要步骤之一。
本文档将介绍核酸提取的基本流程，并提供一些注意事项，以确保提取过程的准确性和可靠性。
2. 核酸提取流程核酸提取的基本流程如下：步骤一：样本处理- 将样本收集至离心管中，并确保样本来源明确和标识清楚。
- 根据实验需要，进行样本预处理步骤，如组织粉碎、细胞裂解等。
步骤二：细胞裂解- 使用适当的细胞裂解缓冲液对样本进行裂解。
- 考虑使用机械破碎、化学裂解或酶裂解等方法根据样本类型进行处理。
步骤三：蛋白质去除- 加入适当的蛋白质沉淀剂，如氯仿、酚/氯仿等，将蛋白质沉淀下来并分离。
步骤四：核酸沉淀- 加入等体积的异丙醇或其他适当的溶剂，将核酸沉淀下来。
- 使用离心等方法将核酸沉淀回收。
步骤五：核酸洗涤- 使用洗涤缓冲液对核酸沉淀进行洗涤，以去除残留污染物。
- 使用离心等方法将洗涤后的核酸沉淀回收。
步骤六：核酸溶解- 加入适量的溶解缓冲液，使核酸完全溶解。
- 定量测定溶解后的核酸浓度，并保存在-20°C或更低温度下。
3. 注意事项- 样本处理过程中要保持样本的完整性和纯净性。
- 制备细胞裂解缓冲液时，要根据样本类型和研究目的作出合理选择。
- 注意在蛋白质去除步骤中避免蛋白质和核酸的干扰。
- 在核酸沉淀过程中，处理时要避免核酸的降解和损失。
- 核酸洗涤时，要严格控制洗涤时间、温度和离心速度，以提高洗涤效果。
- 核酸溶解过程中，要充分溶解，避免出现团块和有机溶剂残留。
以上是核酸提取流程及注意事项的基本内容，希望对您的核酸提取实验有所帮助。
核酸样本采集流程及注意事项
核酸样本采集流程及注意事项一、核酸样本采集流程1.采集器械准备：准备所需采集器具，包括呼吸道采样用的试管、棉签、采集管、采集袋等。
2.个人消毒：采集人员应严格按照个人防护要求进行消毒，戴上帽子、口罩、手套等，确保操作环境的洁净。
3.采样器械消毒：将采集用的器械浸泡于含有消毒液的容器中，保证完全消毒。
4.采集前准备：告知被采集者相关信息，包括采集的目的、过程、时间等，征得其同意，并填写相关采样表格。
5.采集样本：对于呼吸道采样，可以通过鼻咽拭子或者咽拭子进行采集。
采集者戴好手套后，轻轻插入拭子到被采集者的鼻腔或咽喉处，旋转几次后慢慢取出。
将拭子立即放入带有病毒保存液的管中。
6.采集完毕：将采集好的样本放入采集袋，并严密封口，确保不发生泄露，将相关信息填写在采样袋上。
7.处理废弃物：将采集器具集中在一起，进行高温高压处置，或者进行焚烧处理。
8.存储与运输：将采集好的样本放入专用的冷藏盒中，确保样本处于适宜的温度，避免样本在运输过程中的降解或可能的感染。
二、注意事项1.个人防护：采集人员应严格按照卫生部门和相关规定的个人防护要求进行操作，包括正确佩戴口罩、帽子、手套等，避免交叉感染。
2.采集时间：对于不同采样方法，有不同的采样时间要求，一般来说，拭子应在采样后立即放入保存液中，避免样本的降解和污染。
3.采样技术：采集者应具备专业技能，避免伤害被采集者，并确保采样的准确性和完整性。
4.采样部位：针对新型冠状病毒，一般采用鼻咽拭子和咽拭子的方法进行采样，各个机构可以根据需要选择合适的采样部位。
5.采集管选择：采集管应选用无菌封闭的试管，带有病毒保存液，能够保证样本质量和安全性。
7.样本保存：采集好的样本应及时放入冷藏盒中，并严密封口，将温度控制在适宜范围内，避免样本的降解和污染。
8.废弃物处理：采集器具应进行严格消毒和高温高压处理，避免采集过程中的交叉感染。
9.运输要求：采集好的样本应保持冷链运输，避免样本在运输过程中的降解或可能的感染。
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B：新型低毒染料： • 如Gold View、SYBR GreenⅠ、 SYBR Gold等。 • 毒性较低，但价格较昂贵。 • 灵敏度较好，但不如EB。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
4.琼脂糖胶液制备（1%，50 ml）
4.1 称取0.5 g琼脂糖，置于250 ml锥形瓶中，加入
——重新沉淀
DNA中残留有金属离子
——重新70%乙醇漂洗
基因组DNA提取常见问题分析
DNA降解
– 材料不新鲜或反复冻融 – 未很好抑制内源核酸酶的活性 – 提取过程操作过于剧烈，DNA被机 械打断 – 外源核酸酶污染
基因组DNA提取常见问题分析
DNA提取量少
实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料
60 ml 1×TAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶 解。一般需反复煮沸3次，琼脂糖才能充分溶解。加热过 程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。 加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发；
4.2
待胶液冷却至60℃左右时，加入5%的Gold View
染料，混匀，既成琼脂糖胶液。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
学 习 汇 报
核酸提取的原理及方法
汇报人:富贵 青海大学2010级研究生
前言
• 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此，核酸的提取是分子生物学实验技术 中 最 重 要 、 最 基 本 的 操 作 。
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
1.实验器材
台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。
2.实验耗材
无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。
3.实验试剂
质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培养基、抗生素、 琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞 中只有一份或几份拷贝；
• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进
行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物
处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素 处理才能达到更高拷贝数。
离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理
离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂 解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液
将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗
脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
质粒DNA提取及检测——实验准备
——减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。
解决办法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。
RNA提取常见问题分析
电泳带型异常
上样量超过 3μg 电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧
均可能导致 28S 和 18S 条带分不开
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳
DNA的琼脂糖凝胶电泳
1 原理： DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带 负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖 凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子 形状的核酸，其移动速度有差异。因此， 利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效 应，达到分离核酸的目的。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
2. 琼脂糖凝胶分离DNA的范围
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚容易去除。
该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可 溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA （pH 8.0） 20 mM NaCl 0.4 M CTAB 2% (W/V) β-巯基乙醇 0.1%（V/V） 使用前加入
基因组DNA提取——CTAB法
• CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 终浓度
Tris-HCl EDTA NaCl （pH 8.0） （pH 8.0）
100 mM 20 mM
CTAB
PVP40
β-巯基乙醇 2%（V/V） 使用前加入
0.4 M 3% (W/V) 5% (W/V)
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同 时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
TRIzol试剂
TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫 氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白 质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽
提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后
可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋 白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为 DNA和蛋白质。
7.电泳
加完样后立即接通电源。控制电压小于8
V/cm，电流在100 mA以上。当溴酚蓝条带移动
到凝胶2/3时，停止电泳。
8.成像
在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。 保存图像。
倒胶温度不要太低； 先赶气泡、再插梳子。
胶液60℃ 加染料
凝固20~30min
混匀样品不能有气泡； 更换Tip。
反复煮沸3次、锥形瓶封口
10 μg/ml RNase A 10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 1 mM EDTA （pH 8.0 ）
洗脱液 EB
质粒DNA提取——实验流程
对数期菌体 上清液
溶液I充分重悬
过柱
质粒DNA溶液
溶液II裂解
离心洗涤
溶液III中和
干燥溶解
质粒DNA提取——电泳检测
琼脂糖凝胶电泳检测
总RNA提取——样本准备
植物/动物组织样本：
新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80℃。 为避免反复冻融，需小份分装（50~100 mg/份）。
细胞样本：
新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80℃冻存细胞沉淀。
血液样本：
新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80℃ 冻存细胞沉淀。
一．核酸简介
二．基因组DNA提取
三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳
总RNA提取——通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）
原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一
部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电
荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向 疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性， 因此向水层移动。
4.实验材料
对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α）
质粒DNA提取——碱裂解法
碱裂解法试剂配方
组分1 Ⅰ液 Ⅱ液 25 mM Tris-HCl （pH 8.0） 0.2 M NaOH 组分2 10 mM EDTA（pH 8.0 ） 1% SDS
Ⅲ液
RNase A
3 M KAc （pH 4.2）
基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法实验流程
植物材料
抽提
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
DNA溶液
基因组DNA提取——SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能 裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白 质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
质粒DNA的三种带型： 1.共价闭合环状DNA分子： 质粒双链没有断裂；超螺 旋结构；泳动速度最快； 2.半开环质粒DNA分子： 质粒的一条链断裂；松弛 的环状分子；泳动速度最 慢； 3.线性DNA分子：质粒的 两条链均断裂；泳动速度 居中。
质粒DNA提取常见问题
RNA残留
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ质粒断裂 量少
质粒DNA提取常见问题分析
RNA残留
忘记加RNase A？ I液中RNase A失效？ 酶量不够？
质粒断裂
II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈
质粒DNA提取常见问题分析
量少
凝胶是否有问题？ 菌体量少 菌体重悬不彻底 裂解不完全 菌株老化 严谨型质粒
质粒类型
真核细胞总RNA提取——实验步骤
293细胞样品为例
收集细胞 上层溶液
干燥溶解
裂解变性
异丙醇沉淀
RNA溶液
抽 提
离心洗涤
RNA提取常见问题
RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常
RNA降解
外源RNase的污染 裂解液质量 裂解液用量不足 样品本身富含RNase 环境温度过高
小鼠gDNA电泳图
基因组DNA提取常见问题
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR 反应
DNA降解 DNA量少