HLA-B5801遗传标记
HLAB27 和HLAB5801 基因检测的应用
HLA-B*27的临床检测
➢ 基于流式细胞术的 HLA*B27临床检测是目前临床上应 用最广的检测方法，由于流式细胞仪比较昂贵，试剂 价格也比较高，目前在一些基层医院还很难开展。
➢ 别嘌呤醇诱导的严重皮肤过敏反应与 HLA-B*5801基因 型密切相关，且过敏反应的严重程度与携带HLAB*5801基因型呈正相关
[方忠俊, 季蔚青, 张婧娴,等. 痛风性关节炎患者HLA-B*5801基因型携带率及相关实验室指标分析[J]. 检验医学 2021年36卷9期, 896-900页, ISTIC CA, 2021:上海中医药大学预算内课题资助. 张卫忠, 王友莲. 江西某痛风村患者诊治及HLA-B5801基因携带情况分析[J]. 江西医药, 2017, 52(7):4. 李焱, 汤雪薇, 吴洁莹,等. 广东汉族人群HLA-B基因多态性研究[J]. 中华医学遗传学杂志, 2006, 23(1):5.
HLA*B27 和HLA*B5801 基 因检测的应用
概述
➢ MHC是主要组织相容性抗原，一个广泛的统称。人的 MHC 称HLA 复合体。
➢ HLA与人类的免疫系统功能密切相关,包括一系列紧密 连锁的基因座，部分基因编码细胞表面抗原，成为每 个人的细胞不可混淆的“特征”，是免疫系统区分自 身和异体物质的基础。
方忠俊, 季蔚青, 张婧娴,等. 痛风性关节炎患者HLA-B*5801基因型携带率及相关实验室指标分析[J]. 检验医学 2021年36卷9期, 896-900页, ISTIC CA, 2021:上海中医药大学预算内课题资助. 张卫忠, 王友莲. 江西某痛风村患者诊治及HLA-B5801基因携带情况分析[J]. 江西医药, 2017, 52(7):4. 李焱, 汤雪薇, 吴洁莹,等. 广东汉族人群HLA-B基因多态性研究[J]. 中华医学遗传学杂志, 2006, 23(1):5.
福州市汉族人HLA-B＊5801基因多态性与别嘌醇所致严重皮肤不良反应关
ｌ ｅ ｕ ｋ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ， ＨＬ Ａ） 遗传 易感性、 药 物抗 原 相 互 作用 、 细胞 毒性 Ｔ淋 巴细胞 （ ｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ ｔ ｏ ｘ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｌ ｅ ｕ — ｋ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ，Ｃ Ｔ Ｌ ） 的活化和 免疫介 质存 在相 关 性［ ６ ］ 。因 此， 笔者 拟 探 讨 别 嘌 醇所 致 Ｓ Ｃ ＡＲ与 ＨＬ Ａ ＿ Ｂ ５ ８ ０ １
州市汉族人服用别 嘌醇所致 ｓ ｃ ＡＲ 与 ＨＬ Ａ— Ｂ ５ ８ ０ １ 基 因有 关 。 关 键 词 ： ＨＩ Ａ Ｂ ５ ８ ０ １ ；别 嘌 醇 ； 严 重 皮 肤 不 良反 应
中 图分 类 号 ： Ｒ１ ９ ５ ． １ ；Ｒ３ ９ ２ ． １ １ ；Ｒ３ ９ ４ ． ２ ；Ｒ７ ５ ８ ． ２ ５；Ｒ９ ７ １ ． １ ；Ｒ９ ７ ７ ． ３
廖 伟 坚 ，李泳 宁 ，梁 文瑜 ，黄剑 清。
摘要： 目 的 探讨 别 嘌 醇 所 致 严 重 皮 肤 不 良反 应 （ ｓ ｃ ＡＲ） 与 ＨＩ Ａ — Ｂ ５ ８ ０ １基 因 的关 系 。 方 法 将 服 用 别
嘌醇后致 Ｓ Ｃ ＡＲ 的 ２ １ 例 患者作为别嘌醇 Ｓ Ｃ ＡＲ组 ， ３ Ｏ例 服 用 别 嘌 醇 后 未 出 现 Ｓ Ｃ ＡＲ 的 患 者 作 为 别 嘌 醇 耐 受 组 ， 另选取 ５ ３例 健 康 体 检 者 作 为 正 常 对 照 组 。对 ２组 患 者 及 正 常 对 照 组 血 液 进 行 ＨＩ Ａ ＿ Ｂ ５ ８ ０ １基 因 检 测 ， 观 察 其
ＨＩ Ａ — Ｂ ５ ８ ０ １阳 性 基 因例 数 及 频 率 。 结 果 别 嘌 醇 Ｓ Ｃ ＡＲ 组 、 别 嘌 醇 耐 受 组 及 正 常 对 照 组 的 ＨＬ Ａ — Ｂ ５ ８ ０ １阳
服别嘌醇，最好先做基因检测
家庭医药 2016.0540用药之道·选药指南用药编辑/赵欣****************降尿酸药物不少，其中别嘌醇是痛风患者再熟悉不过的药物。
作为目前上市时间最长、价格最为低廉、应用最为广泛的降尿酸药物，可以说别嘌醇在人类对抗痛风这场战争中立下了汗马功劳。
直至今日，别嘌醇仍在临床广泛应用。
然而，别嘌醇虽然疗效肯定，它也有明显的不良反应。
剥脱性皮炎，让医生都“怕”别嘌醇1966年被美国食品和药品管理局（FDA）批准用于痛风和尿酸性关节炎治疗。
目前在美国和欧洲约有25%～30%的痛风患者接受别嘌醇的治疗。
别嘌醇耐受性较好，不良反应发生率为3%～5%，有皮肤系统反应、胃肠道反应、转氨酶升高等，其中以皮肤系统不良反应发生率最为严重。
其中，剥脱性皮肤坏死症是一种严重的皮肤超敏反应，发生率大约为0.1%～0.4%。
其主要引起皮肤剥脱和黏膜的破坏，还会累积到器官系统，死亡率高达20%～30%。
由于这一严重皮肤不良反应，业内甚至出现医生“不敢第一个开别嘌醇”的顾虑，严重影响到医生对别嘌醇的用药决策和患者的依从性，也增加了临床使用的风险。
不过，别嘌醇发生剥脱性皮炎的风险，并非人人平等，而是与患者是否携带一个叫做HLA-B5801的基因有关。
HLA-B5801已被多种指南认定为是别嘌醇严重皮肤反应的最大危险因素和特异性基因标志物。
HLA-B5801在不同种族间分布存在差异性，中国汉族人和泰国人该基因频度较高，达到8%左右；白种人和日本人的基因频率仅为1%和0.5%。
如果携带该基因，使用别嘌醇发生严重过敏反应风险的可能性更大。
早在 2008 年，中国台湾地方行政部门就已经发布指令，在服用别嘌醇前必须进行HLA-B5801 检测。
美国风湿病学会在2012年的痛风诊治指南中也建议，特殊人群在服用别嘌醇前检测HLA-B5801基因，这些人群包括：有3级以上的慢性肾脏病（CKD）的韩国裔；所有的中国汉人、泰国裔。
人类HLA基因图及其遗传特征
人类HLA基因图及其遗传特征在人类MHC称为HLA（human leucocyte antigen)，是迄今为止所知的人类最复杂的基因族。
除成熟的红细胞外，HLA抗原几科分布于人体的各种有核细胞以及血小板。
由于此组抗原首先在人外周血白细胞上发现，同时表达抗原水平较高，目前多采用外周血淋巴细胞来检测这类抗原的型别，故称为人类白细胞抗原（HLA)。
(一)HLA基因定位HLA基因群定位于第6号染色体的短臂。
至1991年底，HLA基因座位已确定确定近60个，正式命名的等位基因278个。
这些基因分类的方式主要有以下两种。
（1)传统的分类法，即把HLA分为与小鼠H-2相似的I类、Ⅱ类和Ⅲ基因，（2)1991年Bodmer建议将它重划分的三类：第一类包括传统分类中的HLA-Ⅰ类和Ⅱ类，还包括一对DMA和DMB；第二类称为免疫功能相关基因，包括C4、Bf、C2、TNFA、TNFB、HSP70、TAP1、TAP2和TAP7等；第三类是一些与上述无关的基因。
本章仍按传统分类法进行介绍。
HLA占第6号染色体很窄的一个区带，估计占人体整个基因组的1/3000，长约3500kb（图6-3、6-4)。
利用交换率越大基因座位距离越远，交换率越小基因座位距离越近的原理，可以通过交换率的计算作基因图，经过家谱分析和交换率的计算作基因图，A-B座位的交换率为0.8分摩（centi Morgan,cM。
是基因交换率在基因图上的图距单位，重组频率在1%的两个连锁基因之间的距离为1cM)，A-C为0.6cM，B-C为0.2cM，B-D为0.8cM，HLA基因群全长距离约为4cM。
自1964年以来，每隔3-4年召开一次国际组织相容性工作讨论会（International Histocompatibility Workshop,IHW),最近一次于1991年11月在日本横滨召开，并预定于1995年在法国召开第12次IHW。
经过这些会议陆续报告了HLA的许多基因及大量的行装位基因。
8. 陈小平-药物代谢酶和药物作用靶点基因检测指南
床旁CYP2C19基因检测与氯吡格雷个体化用药
Robert JD, et al. Lancet 2012;379:1705-11
Overall cohort
CYP2C19 wildtype Carriers of CYP2C19*2
基因导向的华法林个体化用药缩短达稳态剂量的时间
Pirmohamed M. et al. N Engl J Med 2013
标本拒收
无标签 标签不清晰 采血管破裂 已开盖 抗凝剂不符合要求（如肝素抗凝） 运送时间超过1周 肿瘤组织标本量或肿瘤细胞含量达 不到要求，未按要求预处理标本； 送检项目不清晰
标本的保存
血液标本：2～8℃保存（最长不超过72h），尽 量24h内提取DNA；
骨髓：立即提取DNA；RNA检测标本干冰送达， 采样后4h内提取RNA，或去除红细胞后冻存。 组织标本：DNA分析标本2~8℃放置不超过24h, -70℃或更低的温度可长期保存；RNA分析标本 采样后4h内提取RNA，或标本速冻后-70℃或更 低的温度长期保存；
石蜡包埋组织：DNA分析室温条件下可无限期放 置，不建议用作RNA分析。
分析中质量保证
实验室设计要求 仪器设备的使用、维护与保养 检测方法 人员培训
检测体系的性能验证
1. 实验室设计要求
测序间 芯片分析 质谱分析 ……
缓冲间
标准PCR实验室
2. 仪器设备的使用、维护与保养
步骤：PCR扩增、PCR产物纯化、测序反应、电 泳测序、结果分析； 优点：测序长度较长，可发现新的变异位点；
缺点：灵敏度不够高，出现假阴性；不易普及； 成本相对较高，通量低。
HLA-B5801单克隆抗体的制备及特异性检测
HLA-B*5801单克隆抗体的制备及特异性检测目的:痛风是一种由单尿酸钠结晶沉积而引起的炎性关节炎,近年来,随着饮食结构等因素的改变,发病率逐渐增高,已成为严重危害人类健康的疾病之一。
别嘌呤醇作为临床治疗痛风的一线药物,自1963年用于治疗痛风性关节以来,疗效肯定。
然而临床应用中发现别嘌呤醇的诸多不良反应,研究表明别嘌呤醇的过敏反应与HLA-B*5801基因有着密切的联系。
因此,基因型的检测为于展开个体化用药,减少药物不良反应提供依据。
本研究的目的在于研究制备一种靶向于HLA-B*5801多肽的单克隆抗体,鉴定其特异性和敏感性,并探讨其作为检测HLA-B*5801基因的单克隆抗体的检测抗体的可能性。
方法:合成HLA-B*5801胞外段超变区域多肽,将该多肽作为抗原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合技术,产生融合的杂交瘤细胞,ELISA筛出分泌目的抗体特异性较高的细胞孔,经多次亚克隆,获得稳定分泌靶向于HLA-B*5801胞外段区域单克隆抗体的细胞株。
常规方法制备腹水并用蛋白G柱亲和层析纯化该单克隆抗体,Western blot 鉴定纯化抗体的纯度。
倍比稀释法检测该单克隆的效价,单克隆抗体亚类检测试剂盒检测抗体的亚类,ELISA和Western blot检测其特异性。
结果:经单克隆技术和亚克隆筛选获得稳定表达HLA-B*5801的单克隆抗体细胞株,经腹水法生产获得单克隆抗体,将该抗体命名为1E1、2A3,鉴定其亚类为IgGl、κ型,验证其抗体效价为1E1—1014,2A3—1010,并通过HLA-B*5801基因检测试剂盒筛选HLA-B*5801阳性患者及阴性患者,通过ELISA及Western blot 鉴定该抗体特异性结合HLA-B*5801蛋白,筛选阳性及阴性患者。
结论:筛选所获得的亚克隆抗体,经ELISA和Western blot验证,其可特异性的与HLA-5801多肽结合,并具有较高的效价,提示该抗体可作为临床筛选对别嘌呤醇过敏的痛风患者。
HLA-B5801 等位基因荧光探针PCR介绍+说明书
方法如下： （以一次进行 4 个测试为例）
组分名称 主反应液 Taq 核酸聚合酶
灭菌水 核酸样本
总体积
加量 μl/管 3 0.2 13 2
重新测定 注2
1. 本品仅用于科学研究； 2. 需具有经验和专门培训过的人员进行操作； 3. PCR 操作各阶段应在不同的实验室中进行； 4. PCR 操作每个阶段使用专用的仪器和设备； 5. 穿工作服，戴一次性手套； 6. 必须使用一次性吸头，吸完即弃； 7. 用 10%次氯酸或 70%酒精或紫外线灯处理工作台和加样器； 8. 仅严格遵守本说明书规范操作所得到的测试结果为有效测试数据； 9. 本试剂盒所有使用的仪器设备包括荧光 PCR 仪及可调式移液器等均需依照规定进行校正； 10. 实验中使用的 Taq 核酸聚合酶(DNA polymerase) 以 Fermentas 厂牌为标准，使用其它厂牌之 Taq 核酸聚合酶可
本公司人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段 B5801 荧光分型试剂盒以序列特异性引物进行荧光聚合 酶链反应，用以人类主要组织相容性抗原分子型别鉴定。 【检测原理】
本试剂盒以序列特异性引物进行荧光聚合酶链锁反应，用于人类主要组织相容性抗原分子型别鉴定。首先由已 知人类主要组织相容性抗原分子基因序列设计特异性引物及探针，当引物序列与待测标的序列能完全配合时，引物 进行聚合酶链锁反应。特殊核酸片段将被进行复制与放大，同时探针结合上待测标的序列并藉由聚合酶的分解作用 产生荧光。荧光反应产生表示在样本中存在与特异性引物匹配的基因序列，反之则否。
用于检测HLA-B5801等位基因的试剂盒及其检测方法和应用[发明专利]
![用于检测HLA-B5801等位基因的试剂盒及其检测方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/0e945f0559fb770bf78a6529647d27284b7337ad.png)
专利名称：用于检测HLA-B*5801等位基因的试剂盒及其检测方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：叶绍云,万楠,刘国凤,杨小娟,蒋峻峰,袁海琴,孟浩浩,叶强
申请号：CN201810499371.7
申请日：20180523
公开号：CN108624676B
公开日：
20220401
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了用于检测HLA‑B*5801等位基因的试剂盒及其检测方法和应用，属于生物检测技术领域。
所述试剂盒包括用于确定待检测样本分型为HLA‑B*58的引物，以及用于确定所述检测的HLA‑B*58样本分型为HLA‑B*5801的引物；本发明通过设计待检测目的片段的引物，先将其通过PCR扩增富集，再通过扩增的待检测目的片段的检测引物，PCR扩增检测，能够减少假阳性率；并且通过设计的两对特异引物和其对应的两对检测引物能够使检测结果更为准确，其中第一对特异引物和第一检测引物可以确定待测样本为分型为HLA‑B*58；第二对特异引物和第二检测引物可以确定待检测样本分型为HLA‑B*5801；排除非特异扩增的干扰能力强。
申请人：健路生物科技(苏州)有限公司
地址：215000 江苏省苏州市工业园区生物纳米园星湖街218号B2栋505-506单元
国籍：CN
代理机构：苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李艾
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Fig. 1. Screening of candidate SNPs for association with allopurinol-induced SCAR. On the x axis, 823 SNPs are ordered by their chromosome positions; 197 SNPs in the MHC region are those numbered from 260 to 456. On the y axis, the log10 P values were calculated by comparison of the genotype frequencies between the allopurinol–SCAR patients and tolerant group.
SNP Genotyping
A total of 823 SNPs： 197 SNPs from 4Mb of the MHC region 626 SNPs selected from genes encoding immune-related molecules and drug metabolizing enzymes
HLA-B*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse reactions caused by allopurinol
研发部 张艳
别嘌呤醇作用
用途：治疗痛风、高尿酸血症等相关疾病。 机理：抑制黄嘌呤氧化酶的活性
副作用：皮肤不良反应如HSS、SJS和TEN
HLA Allele Frequency
Discussion
In fact, the association is 100% in that the HLA-B allele B*5801 was present in all 51 patients with allopurinolinduced SCAR, with an odds ratio exceeding that reported for the association between HLAB27 and ankylosing spondylitis genotyping the B*5801 allele may provide a better guidance of avoiding allopurinol-induced SCAR in patients with renal insufficiency than dosage adjusting.
HLA-B*5801 is necessary but not sufficient for allopurinol–SCAR. The present study revealed that CFLAR, an apoptosis regulator,could also be involved in allopurinol–SCAR
This study, together with the previous reports, suggests that HLA-B alleles andor other genetic polymorphisms in the MHC region might play a major role in the pathogenesis of immune-mediatedSCAR.
Characteristics of Patients and Controls
SJS (13 cases), SJSTEN (5 cases), TEN (3 cases), and HSS (30 cases),
Association Screen for Candidate Gene SNPs
Statistical Analysis
Categorical data were compared between groups with use of Fisher’s exact tests, and continuous data(presented as median, with range given in parentheses) were compared with use of t tests. All P values were two-tailed; a P value of 0.05 was considered to indicate statistical significance. Allelic association screen was carried out by the Cochran– Armitage Trend test for each SNP . Odds ratios were calculated with Haldane’s modification, which adds 0.5 to all cells to accommodate possible zero counts . The corrected P (Pc) values were adjusted by using Bonferroni’s correction for multiple comparisons to account for the observed alleles (17 for HLA-A, 40 for HLA-B, 19 for HLA-C, and 30 for HLADRB1). Therefore, the Pc values were multiplied by a factor of 387,600.
Patients and Control Subjects Recruitment
228 control individuals： (135 allopurinol-tolerant subjects 93 healthy subjects） 51 patients with allopurinol–SCAR
HLA Genotyping
HLA alleles A, B, C, and DRB1, were determinedeverse lineblot
Potential ambiguities were resolved by sequencing-based typing