物理方法诱导细胞融合的进展

1991年Naton等提出利用融合对象间密度的差异来实现融合时的有 年 等提出利用融合对象间密度的差异来实现融合时的有 序队列。在两电极间放入合适密度的媒质,混合的两种类型的原生质体就 序队列。在两电极间放入合适密度的媒质 混合的两种类型的原生质体就 会形成两个不同的单层结构;在此情况下 可以获得很高的异核融合产率。 在此情况下,可以获得很高的异核融合产率 会形成两个不同的单层结构 在此情况下 可以获得很高的异核融合产率。 融合率取决于所加电场的方向,如果接触区域是建立在阳极面 如果接触区域是建立在阳极面,那么融合 融合率取决于所加电场的方向 如果接触区域是建立在阳极面 那么融合 率就会比建立在阴极面提高两倍。他们采用的实验样本是美洲狼尾草叶 率就会比建立在阴极面提高两倍。 肉细胞和烟草叶肉细胞的原生质体。 肉细胞和烟草叶肉细胞的原生质体。 1993 年俄罗斯研究人员 年俄罗斯研究人员Abidor等采用了一种新的方式来研究细胞 等采用了一种新的方式来研究细胞 融合和高电场中细胞膜的电学特性。他们将L929 细胞和其它的四种类 融合和高电场中细胞膜的电学特性。他们将 型细胞的悬浮液放入特殊的腔室中,通过离心力作用将细胞紧压同时所测 型细胞的悬浮液放入特殊的腔室中 通过离心力作用将细胞紧压同时所测 量紧压体系的电阻值间接地发映出离心过程中状态的变化情况,并通过对 量紧压体系的电阻值间接地发映出离心过程中状态的变化情况 并通过对 比试验揭示出膜接触程度的近与远是影响细胞融合率高与低的关键因素 膜接触程度的近与远是影响细胞融合率高与低的关键因素。 比试验揭示出膜接触程度的近与远是影响细胞融合率高与低的关键因素。 2000年Mekid等首次报道了电场作用下组织中发生细胞电融合过程 等首次报道了电场作用下组织中发生细胞电融合过程, 年 等首次报道了电场作用下组织中发生细胞电融合过程 他们采用B16鼠科黑素瘤组织 在不施加和施加 鼠科黑素瘤组织,在不施加和施加 他们采用 鼠科黑素瘤组织 在不施加和施加500 V / cm, 1 350 V / cm, 2 000 V / cm等不同场强条件下 得到了电融合后的细胞并通过相 等不同场强条件下,得到了电融合后的细胞并通过相 等不同场强条件下 互对比得出高场强作用下融合过程比较明显的实验结果。 高场强作用下融合过程比较明显的实验结果 互对比得出高场强作用下融合过程比较明显的实验结果。 虽然此时细胞融合率已经比较高,但是电极间距离仍然属于毫米级 但是电极间距离仍然属于毫米级,所 虽然此时细胞融合率已经比较高 但是电极间距离仍然属于毫米级 所 以在进行细胞电融合时,电压必须提高到 电压必须提高到300 V以上才能够达到细胞电融 以在进行细胞电融合时 电压必须提高到 以上才能够达到细胞电融 合所需的电场强度。此外,融合装置体积比较大但是细胞融合通量较低 融合装置体积比较大但是细胞融合通量较低, 合所需的电场强度。此外 融合装置体积比较大但是细胞融合通量较低 这些不利因素都限制了细胞电融合的推广。 这些不利因素都限制了细胞电融合的推广。
物理方法诱导细胞融合的进展
一.细胞融合简介 二.传统物理融合方法 传统物理融合方法 三.其他物理融和方法 其他物理融和方法
细胞融合技术
是近年来迅速 发展起来的一项新兴细胞工程技术， 发展起来的一项新兴细胞工程技术， 在外力（ 诱导剂或促融剂）作用下， 在外力（ 诱导剂或促融剂）作用下， 2个或 个以上的异源（ 种、属间） 个或2个以上的异源 属间） 个或 个以上的异源（ 细胞或原生质体相互接触， 细胞或原生质体相互接触，从而发生 膜融合、胞质融合和核融合， 膜融合、胞质融合和核融合，并形成 杂种细胞的现象称为细胞融合（ 杂种细胞的现象称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。(cell ）或细胞杂交。 hybridization)它是利用现代科学技 它是利用现代科学技 术，把来自于不同种生物的单个细胞 融合成1个细胞 这个新细胞（ 个细胞， 融合成 个细胞，这个新细胞（杂合 细胞）得到了来自2个细胞的遗传物 细胞）得到了来自 个细胞的遗传物 质（包括细胞核的染色体组合和核外 基因）， ），将具有新的遗传学或生物学 基因），将具有新的遗传学或生物学 特性。 特性。
对细胞无毒；可在镜下观察融合过程 对细胞无毒；
等优点，显示出强大的生命力。 等优点，显示出强大的生命力。
ห้องสมุดไป่ตู้
二.传统物理方法
1.电融合法 1.电融合法
2.激光融合法 2.激光融合法
1.电融合法 1.电融合法
电融合诱导法是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串， 电融合诱导法是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串， 在施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促使细胞融 在施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿， 合的方法。 合的方法。
自从1978年Zimmermann首先采用电脉冲方法成功地 年 首先采用电脉冲 自从 首先采用电脉冲方法成功地 诱导了细胞电穿孔、电融合以来近三十年里,电穿孔和电融 诱导了细胞电穿孔、电融合以来近三十年里 电穿孔和电融 合技术不断发展完善成为一门比较成熟的学科,得到非常广 合技术不断发展完善成为一门比较成熟的学科 得到非常广 泛地应用。 泛地应用。 1983～1988年期间 以Zimmermann为主的工作小组 年期间,以 ～ 年期间 为主的工作小组 通过动物、植物和微生物细胞电融合实验得出高频短脉冲是 通过动物、 可行的。并且认为高频短脉冲电信号可以用于细胞操控、 高频短脉冲电信号可以用于细胞操控 可行的。并且认为高频短脉冲电信号可以用于细胞操控、基 因工程和细胞融合,证明了利用电场这一物理因素诱导细胞 因工程和细胞融合 证明了利用电场这一物理因素诱导细胞 融合具有普遍的适用性。由于电融合的可控性,使人们第一 融合具有普遍的适用性。由于电融合的可控性 使人们第一 次在显微镜下直接观察细胞的融合过程,且电极间细胞的融 次在显微镜下直接观察细胞的融合过程 且电极间细胞的融 合率高达10～ 合率高达 ～80%。 。
细胞融合技术作为细胞工程的核心 基础技术之一,已在农业、医药、 基础技术之一 已在农业、医药、 已在农业 环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域 环保等领域取得了开创性的研究成果 而且应用领域 不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系 核质关系、 不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调 遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、 控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、 的研究提供了有力的手段,而且 衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段 衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段 而且 被广泛应用于免疫学 遗传学、发生生物学,特别是 免疫学、 被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学 特别是 单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十 在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十 分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入, 分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入 细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显 著。
2.激光融合法 激光融合法
20世纪 年代中期又发明了激光融合器 迅速崛起的激光诱 世纪80年代中期又发明了激光融合器 世纪 年代中期又发明了激光融合器,迅速崛起的激光诱 导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜 的细胞膜进行破 导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破 细胞在显微镜下实 或扰动) 可将两个不同特性、 坏 (或扰动 ,可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实 或扰动 可将两个不同特性 不同大小的细胞在显微镜 现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个 靠近另一个细胞并 现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并 光击穿, 紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理 质膜发生光击穿 然后对接触处进行脉冲激光束处理,使 紧密接触 然后对接触处进行脉冲激光束处理 使质膜发生光击穿 产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细 由于质膜上微孔的可逆性 产生微米级的微孔。这样 由于质膜上微孔的可逆性 细胞开始变 形融合,最终成为一个细胞 最终成为一个细胞。 形融合 最终成为一个细胞。 1987 年和 年和1989年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使 年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使 油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟 从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产 油菜原生质体融合 从开始照射到完成融合仅需几秒钟 对融合产 物观测,发现胞质仍在运动 说明融合后的细胞仍能存活。 发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活 物观测 发现胞质仍在运动 说明融合后的细胞仍能存活。 激光微束融合法与以前的病毒法、 激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较 法 电融合法相比较,
细胞融合方法有生物法、 细胞融合方法有生物法、化学法 生物法 和物理法，其中生物方法因病毒制备 和物理法， 困难、操作复杂、 困难、操作复杂、灭活病毒的效价差 异大、实验的重复性差、 异大、实验的重复性差、融合率很低 目前， 等。目前，这种方法主要适用于动物 细胞融合，用于实验室。 细胞融合，用于实验室。化学法因为 存在对细胞损伤大、残存毒性、融合 存在对细胞损伤大、残存毒性、 率较低及经验性大等缺陷， 率较低及经验性大等缺陷，目前应用 也不广。 融合频率高， 也不广。而物理方法因 融合频率高， 是PEG的100倍；操作简便、快速； 操作简便、快速；
可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融 可选择任意两个细胞进行融合 易于实现特异性细胞融 合,作用于细胞的应力小 定时、定位性强,损伤小 参数 作用于细胞的应力小,定时、定位性强 损伤小,参数 作用于细胞的应力小 定时 损伤小 易于控制,操作方便 可利用监控器清晰地观察整个融 易于控制 操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融 操作方便 合过程, 实验重复性好, 无菌,无毒性。 合过程 实验重复性好 无菌 无毒性。 无毒性
2004年日本东京大学的研究人员采用硅电极、玻璃与PDMS相 年日本东京大学的研究人员采用硅电极、玻璃与 年日本东京大学的研究人员采用硅电极 相 结合的微流控芯片制作出了高纵横比的电极,并且采用低电压技术实 结合的微流控芯片制作出了高纵横比的电极 并且采用低电压技术实 现了高效的细胞融合,融合率达到 融合率达到75% 。 现了高效的细胞融合 融合率达到 2007年Jongil等在“芯片实验室”水平上通过电融合手段 实 等在“ 年 等在 芯片实验室”水平上通过电融合手段,实 现了对日本美口菌和珊瑚菜的电融合过程。 现了对日本美口菌和珊瑚菜的电融合过程。他们的芯片是由玻璃作 为基底, 为基底 PDMS通过铸模方式实现微流控通道的制作然后利用等离子 通过铸模方式实现微流控通道的制作然后利用等离子 键合使上下两层紧密结合,很大程度上提高了细胞 很大程度上提高了细胞1: 键合使上下两层紧密结合 很大程度上提高了细胞 1 的对准并发生 融合的概率。在交流电压1 峰峰值8～ 融合的概率。在交流电压 ～2 MHz峰峰值 ～10 V的矩形脉冲作 峰峰值 的矩形脉冲作 用下实现排队过程;然后采用周期为 然后采用周期为10 ～100 毫秒幅值为 毫秒幅值为250 mV 用下实现排队过程 然后采用周期为 的直流脉冲来控制和保持融合。此外,该课题组对电极电场分布进行 的直流脉冲来控制和保持融合。此外 该课题组对电极电场分布进行 了仿真。 了仿真。 同年Wang等采用微流控电穿孔技术 制造了 等采用微流控电穿孔技术,制造了 弹性阀。 同年 等采用微流控电穿孔技术 制造了PDMS弹性阀。当 弹性阀 施加直流电压脉冲时, 阀能够实现快速关断产生电压脉冲序列。 施加直流电压脉冲时 PDMS阀能够实现快速关断产生电压脉冲序列。 阀能够实现快速关断产生电压脉冲序列 在此条件下的细胞融合芯片中的细胞,能够进行排队及融合 能够进行排队及融合。 在此条件下的细胞融合芯片中的细胞 能够进行排队及融合。而且此 技术解决了制造电极和高电压脉冲电源的难度问题。 技术解决了制造电极和高电压脉冲电源的难度问题。