实验5 诱导细胞融合——聚乙二醇法
细胞融合实验报告
一．实验目的1.了解并掌握细胞融合的方法2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用3.掌握化学融合法，了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用二．实验原理两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
主要过程包括：1.制备原生质体：微生物及植物细胞有坚硬的细胞壁，需要用酶将其降解，而动物细胞无需要去壁处理。
2.诱导细胞融合：两种亲本细胞的悬浮液调到一定密度，滴入高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导融合，或用物理方法如电刺激促进融合。
3.筛选杂合细胞：在特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地生长，除去其他未融合的细胞。
细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
三．实验结果与分析讨论融合细胞的观察实验中发现大部分的融合都是3个细胞的融合，两个相互融合的很少基本没有找到。
实验五：细胞融合与凝集
细胞生物学实验
实验结果
土豆凝集素对兔血红细胞的凝集作用
PBS对照
PEG诱导, 鸡血细胞融合情况
实验报告
细胞生物学实验
绘图或照片表示观察到的细胞融合现象,哪些因素 会影响其融合?（进行多个视野的测定，统计平均 融合率.若进行多个时间的融合实验，请比较融合 时间对融合率的影响，分析可能的原因）
➢ 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个具有双核 或多核细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞 均能发生自发融合现象;
➢ 细胞融合可在自然条件下或利用人工条件 (生物的、物理的、 化学的)下进行;
➢ 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处 质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子 层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发 生融合,形成双核或多核细胞 ;
细胞生物学实验
实验五
细胞融合（聚乙二醇法） 凝集素对细胞的凝集反应
实验目的
细胞生物学实验
通过细胞融合的观察
了解细胞融合的原理 掌握用PEG诱导细胞融合的方法
通过细胞的凝集反应的观察
➢ 了解细胞膜的表面结构 ➢ 了解细胞发生凝集反应的原因 ➢ 学习研究细胞凝集反应的方法
实验原理
细胞生物学实验
细胞融合
染色镜检
➢ 取1滴PEG诱导后血细胞悬液滴于载玻片上,再加入0.2% Janus Green B染液1滴，混匀，盖上盖玻片，染色5-15min 后,显微镜下观察观察细胞融合状况;
➢ 注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞
计算融合率(%) 融合率 = 融合细胞数/总细胞数 ×100%
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与 该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百 分比表示, 而且要进行多个视野测定，进行统计分析。
动物细胞融合实验实验报告
动物细胞融合实验实验报告
实验目的：1、了解动物细胞融合的常用方法
2、学习化学融合的基本操作过过程
3、观察动物细胞融合过程中的细胞行为和变化
实验材料：鸡血红细胞、50%PEG溶液、0.85%氯化钠溶液、显微镜、离心机、载玻片、盖玻片等
实验原理：聚乙二醇（PEG）能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分
子层的互相亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
实验步骤：1、取鸡血，离心后去除上清液，以0.85%氯化钠溶液制成5%~10%的悬液
2、加入GKN液4ml，混匀
3、加入14滴PEG液，静置3~5min后混匀，放于显微镜下观察
实验结果：显微镜下可观察到有些细胞发生质膜融合
分析与讨论：细胞融合的应用有微生物原生质体融合构成新菌株、利用原生质体融合和培养技术培育新植物、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体、用于基因定位和绘制人类基因
图谱、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗、用于动物育种、用于细胞疗法等。
实验5诱导细胞融合——聚乙二醇法
10.进行多个视野的测定，统计细胞平均融合率。
五、结果与分析
1、绘制观察到的融合细胞图，计算观察到的细胞 融合率；
2、简述聚乙二醇法诱导细胞融合的原理及影响融 合的关键因素。
六、注意事项
如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行 灭菌，采血在无菌条件下进行。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构， 使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组， 由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼 此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融 合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括 已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比 表示。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用从而使细胞发生融合
实验五 诱导细胞融合——聚乙二醇法
一、实验目的 了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导
细胞融合的方法。 二、实验原理 聚乙二醇（PEG）结构为： CH2(OH)-(CH20CH2)n-CH2OH； 相对分子质量在2000-6000均可用作细胞融合剂。
6.取悬液1mL到7ml离心管中，加入0.5～0.8 mL预热 的50％PEG （慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边 轻摇离心管,使其混匀），38℃水浴中温浴30min。
7.缓慢加入Hanks液5ml以终止PEG的作用，轻轻吹 打混匀，38℃水浴中静止5min。
8.1000r/min离心5min，去上清，指弹使细胞团分散 9.取细胞悬液1滴滴于载玻片上，盖上盖玻片直接镜
细胞融合的化学方法
细胞融合的化学方法细胞融合是指将两个或多个细胞融合为一个新的细胞。
这一方法在生物学研究和生物工程等领域具有广泛的应用。
细胞融合可以用于研究细胞间的相互作用、合成新的细胞群体、产生新的抗体等。
下面将介绍几种常用的细胞融合方法。
1.化学融合法化学融合法是最早发展起来的细胞融合方法之一、它利用化学物质促进细胞膜的融合，使细胞内的细胞质相互融合。
常用的化学物质有聚乙二醇（PEG）和離子介質抗殺（HVJ）。
聚乙二醇融合法是通过将两个或多个细胞暴露在含有PEG的溶液中，PEG能破坏细胞膜的完整性，使细胞膜互相融合。
该方法适用于多种类型的细胞，如哺乳动物、昆虫和植物细胞等。
HVJ融合法是利用病毒颗粒HVJ作为媒介，将细胞融合在一起。
病毒颗粒与细胞膜相互结合，导致细胞膜的破裂和融合。
这种方法对于一些类型的细胞如哺乳动物细胞和植物细胞等可行。
2.电融合法电融合是利用外加电场的作用使细胞融合的方法。
将需要融合的细胞以适当的密度分散在含有适当浓度的电解质的缓冲液中，然后施加脉冲电场。
电场作用下，细胞膜发生破裂和融合，形成新的细胞。
这种方法适用于多种类型的细胞，如哺乳动物、细菌、酵母菌等。
电融合法操作简单，且可以改变脉冲电场的参数来控制细胞融合程度和效果，具有一定的灵活性。
3.激光融合法激光融合是利用激光束对细胞进行加热，使细胞膜发生破裂和融合的方法。
激光融合法可以实现高效的细胞融合，且对细胞的形态和功能影响较小。
激光融合法适用于不同类型的细胞，包括哺乳动物、细菌和植物细胞等。
激光对细胞的加热过程需要仔细控制温度和时间，以避免对细胞产生不可逆的损伤。
细胞融合实验报告
聚乙二醇介导的细胞融合2012年2月19星期一陈倩倩（118627140313）同作者：郑梦璐谢雨后赵松1、文摘细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。
但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。
细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视。
自从20世纪70年代Kao和Michayluk用聚乙二醇( PEG, polyethyleneglycol) 诱导大麦、大豆等植物原生质体融合后PEG 法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作简便等优点, 被普遍地应用于生物、遗传、医药等研究领域. 高体积分数、高相对分子质量的PEG会对细胞产生毒性,是限制其被广泛应用的瓶颈, 此外,由于该方法涉及的影响因素较多, 进一步加大了获得理想细胞融合率的难度.本实验主要研究PEG的浓度和细胞浓度对细胞融合率的影响。
2、背景介绍细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。
1958年日本学者阅田善雄用紫外光灭活的仙台病毒在体外诱导艾氏腹水红纲胞相互融合。
1965年他和Harris等在此基础上各自分别采用灭活的仙台病毒,诱导产主了第一个种间融合并培养成活。
一年后Yerganzan又进一步使用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。
后来Littlefield 用缺陷型细胞HGPRT-XTK-细胞杂交,用HAT 选择培养基选出杂种细胞,开创了细胞工程的新纪元,继而推动了整个生物工程的发展。
1975年英国科学家Milestein 和Kohler在体细胞杂交基础上创立了B淋巴细胞杂交瘤技术,他们将在体外不能长期生存的经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）与在体外能迅速增殖的小鼠骨髓溜细胞在聚乙二醇（PEG）或汕台病毒的作用下融合而产生杂交瘤细胞,所得杂交瘤细咆承袭了两种亲代细胞的遗传特性,既保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力,又继承了免疫细胞合成和分泌的能力,即能分泌抗绵羊红细胞的抗体。
peg诱导细胞融合原理
peg诱导细胞融合原理
PEG诱导细胞融合原理
PEG是聚乙二醇的缩写，是一种具有高分子量的线性聚合物。
PEG在
生物学研究中被广泛应用，其中最常见的应用之一就是诱导细胞融合。
细胞融合是指将两个或多个细胞融合成一个单独的细胞。
这种技术被
广泛应用于生物学研究中，例如制备杂交瘤细胞、制备单克隆抗体和
产生转基因动物等。
PEG诱导细胞融合的原理是利用PEG分子与细胞膜相互作用，使得两个或多个不同类型的细胞在PEG存在下发生融合。
具体来说，PEG通过以下机制促进了细胞融合：
1. 破坏细胞膜结构
PEG分子可以与水形成氢键，并且可以与亲水性区域结合。
当PEG溶液与细胞接触时，它会插入到细胞表面，并破坏部分磷脂双层结构，
从而使得两个或多个不同类型的细胞暴露出其内部的细胞质。
2. 促进细胞膜的接触
PEG分子可以通过两种方式促进细胞膜的接触。
首先，PEG可以降低水的表面张力，使得两个或多个细胞之间的距离缩小。
其次，PEG可以与细胞膜表面的亲水性区域结合，从而增加了两个或多个细胞之间的吸引力。
3. 促进细胞融合
当两个或多个不同类型的细胞表面接触时，PEG会形成一个临时性的孔道，使得两个或多个细胞质混合在一起。
这些孔道很快就会关闭，并且新形成的单一细胞会拥有所有原始细胞中所包含的遗传物质和生物学特性。
总之，PEG诱导细胞融合是一种简单、有效、广泛应用于生物学研究中的技术。
它利用PEG分子与细胞膜相互作用来促进不同类型细胞之间发生融合，并且可以产生许多重要的研究工具和应用。
聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合实验原理及步骤
实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合【课前预习】1．介导细胞融合的方法有哪些？2．细胞融合技术有哪些方面的应用？【目的要求】掌握细胞融合原理以及应用PEG 诱导细胞融合的方法。
【基本原理】两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。
细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。
因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。
这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus) ，聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH2OCH2)n CH2OH，相对分子质量在200-6000 均可用作细胞融合剂。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
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一、实验目的
了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导
细胞融合的方法。
二、实验原理 聚乙二醇（PEG）结构为： CH2(OH)-(CH20CH2)n-CH2OH；
相对分子质量在2000-6000均可用作细胞融合剂。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构， 使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，
பைடு நூலகம்
50％PEG混合液配置：称取少许PEG放人刻度离心 管内，在沸水浴中加热， 使其溶化，待冷却至50℃
时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注
意使用前配制。
6.取悬液1mL到7ml离心管中，加入0.5～0.8 mL预热
的50％PEG （慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边
轻摇离心管,使其混匀），38℃水浴中温浴30min。
箱，电炉， 量筒，离 心管，注射器，试管， 移液管，烧杯， 吸管， 载玻片，盖玻片，显微
镜
四、实验步骤
1.鸡血红细胞悬液的制备：
用注射器吸入 1mL Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡血 2mL，注 入刻度离心管内，按照3：1(V/V)加入 6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3~4天。
7.缓慢加入Hanks液5ml以终止PEG的作用，轻轻吹 打混匀，38℃水浴中静止5min。 8.1000r/min离心5min，去上清，指弹使细胞团分散 9.取细胞悬液1滴滴于载玻片上，盖上盖玻片直接镜 检；或加入台盼蓝溶液1滴，染色3分钟盖上盖玻片， 显微镜下观察细胞融合现象。
10.进行多个视野的测定，统计细胞平均融合率。
由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼
此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融
合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括
已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比
表示。
三、实验材料与用品
材料：鸡血红细胞 试剂： 仪器：离心机，水浴
（1）Alsver液： （2）0.85％生理盐水： （3）GKN液： （4）Ringer溶液： （5）Hanks液： （6）50％PEG混合液 （7）0.2%次甲基蓝
五、结果与分析
1、绘制观察到的融合细胞图，计算观察到的细胞
融合率；
2、简述聚乙二醇法诱导细胞融合的原理及影响融 合的关键因素。
六、注意事项
如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行
灭菌，采血在无菌条件下进行。
PEG有毒，请操作过程中勿沾到皮肤上。
2.取细胞悬液1mL，移人7mL离心管， 加入4mL
0.85％生理盐水混匀；2000r/min离心5 min。
3.弃上清液（用吸管吸去），加0.85％生理 盐水至
5mL，混匀后2000r/min离心5min。
4.重复上述条件，再离心洗涤1次。 5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入 适量的 GKN液溶液，按压积红细胞体积配成10％的红细胞 悬液。