PEG促细胞融合实验报告
实验十 PEG法诱导鸡血细胞融合
（7）詹纳绿染液。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
• 影响原生质体融合的因素。 （1）首先是酶解条件： 渗透压稳定剂 Ca2+ 、Mg2+、蔗糖 可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生 质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体 的再生率下降；再就是酶解温度。 （2）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质 体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合 处理。 （3）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质 体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应 用离心方法强迫它们密集
实验 十 PEG法诱导鸡血细胞融合
College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
荧光标记的细胞融合
三．实验仪器、材料和试剂
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。
材料：成年家鸡。
■ 试剂
（1）0.85%NaCl溶液:
实验四 PEG诱导细胞融合
实验四 PEG诱导细胞融合（注：设计性试验）一、实验目的1、了解PEG诱导细胞融合的基本原理。
2、通过PEG诱导鸡红细胞之间的融合实验米初步掌握细胞融合技术二、实验原理两个或两个以上的细胞合并为一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合。
在自发或人工诱导下均可发生。
自然情况下的受精过程即属于这种现象。
不同种细胞的融合也叫做细胞杂交。
基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。
20世纪30年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。
50年代开始人工细胞融合的研究。
60年代初，日本学者冈田（Okada）首次使用仙台病毒诱导动物细胞融合。
70年代后，逐渐采用化学融合剂（如PEG），由于具有使用方便、活性稳定、容易制备和控制等优点，已成为人工诱导细胞融合的主要手段。
80年代初出现了电融合技术，逐渐应用于科学研究。
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（如病毒诱导融合法）、化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）、物理方法（如电场诱导融合法）。
本实验利用PEG诱导细胞融合。
聚乙二醇分子能减少细胞间的游离水，促使细胞聚集；破坏或者改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。
三、实验材料（一）、试剂：1、Alsver’s液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml蒸馏水中。
2、0.85％生理盐水3、GKN溶液：NaCl 8g、KCl 0.4g、Na2HPO4·2H2O 1.77g、Na2HPO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml蒸馏水中。
4、35％PEG液：实验前临时配制，根据需要称取定量PEG（Mw=4000），放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的GKN液，混匀。
实验四 PEG介导的细胞融合
实验四 PEG介导的细胞融合一、实验目的：（1）通过PEG介导的鸡血细胞融合实验，对体细胞融合有一个清楚的概念。
（2）初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。
二、实验原理：利用PEG介导动物细胞融合的原理到目前为止还没有完全定论。
学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起，使两细胞的胞质沟通，从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
利用PEG介导细胞融合，其融合效果受以下几种因素的影响。
1、PEG的分子量与浓度细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG得分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大。
为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000-4000，浓度一般为40%-60%。
2、PEG的pH值经验证，PEG的pH值在8.0-8.2之间融合效果最好。
3、PEG的处理时间处理时间越长，融合效果越好，但对细胞的毒害作用也就越大。
故一般将处理时间限制在1分钟之内。
本实验中那个细胞融合后无需继续培养，故处理时间可适当放宽至数分钟。
4、融合时的温度由于生物膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。
因此，为了获得更好的融合效果，在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。
对于哺乳动物的细胞，一般采用的温度为38℃-40℃。
本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为：①鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；②实验材料便宜、易得。
细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。
细胞内只有1个核，定为未融合细胞；有2至多个核，定为融合细胞。
三、实验用品：1、材料：新鲜鸡血；2、试剂：（1）Alsever液：葡萄糖（2.05g）枸椽酸钠（0.8g）氯化钠（0.42g）重蒸水（至100mL）（2）生理盐水（0.85%）（3）GKN液：氯化钠（8g）氯化钾（0.4g） Na2HPO4•2H2O（1.77g）Na2HPO4•H2O（0.69g）葡萄糖（2g）酚红（0.01g）溶于1000mL重蒸水中（4）50%PEG液（现用现配）：根据实验需要，称取适量PEG（Mr.4000）放入刻度离心管内，在酒精灯上将其融化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热的GKN液并充分混匀。
实验5诱导细胞融合——聚乙二醇法
10.进行多个视野的测定，统计细胞平均融合率。
五、结果与分析
1、绘制观察到的融合细胞图，计算观察到的细胞 融合率；
2、简述聚乙二醇法诱导细胞融合的原理及影响融 合的关键因素。
六、注意事项
如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行 灭菌，采血在无菌条件下进行。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构， 使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组， 由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼 此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融 合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括 已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比 表示。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用从而使细胞发生融合
实验五 诱导细胞融合——聚乙二醇法
一、实验目的 了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导
细胞融合的方法。 二、实验原理 聚乙二醇（PEG）结构为： CH2(OH)-(CH20CH2)n-CH2OH； 相对分子质量在2000-6000均可用作细胞融合剂。
6.取悬液1mL到7ml离心管中，加入0.5～0.8 mL预热 的50％PEG （慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边 轻摇离心管,使其混匀），38℃水浴中温浴30min。
7.缓慢加入Hanks液5ml以终止PEG的作用，轻轻吹 打混匀，38℃水浴中静止5min。
8.1000r/min离心5min，去上清，指弹使细胞团分散 9.取细胞悬液1滴滴于载玻片上，盖上盖玻片直接镜
PEG诱导的细胞融合实验
【实验操作】
1、调整肿瘤细胞浓度：处死小鼠，抽取腹水，计数 细胞浓度，用Hanks液稀释成个107个/ml
2、配2％鸡红细胞悬液：肝素抗凝鸡血1000rpm离 心5min，去血浆；按红细胞压积用Hanks液配成2 ％悬液（约108个/ml）。
【实验目的】
• 了解聚乙二醇诱导细胞融合的原理与技术； • 学会鉴别融合细胞。
【实验材料及用品】
一、实验材料： 1、鸡红细胞 2、小鼠腹水瘤细胞 二、实验器材 普通离心机 水浴锅：50ºC，37ºC 计数板
三、实验试剂
1、180IU/ml肝素钠生理盐水溶液 2、Hanks溶液 3、50％PEG：将10gPEG加入带盖离心管中，
用细胞融合方法培育的薯番茄
细胞融合抗盐碱耐干旱葡萄新品种
细胞融合生产 单克隆抗体
细胞融合的诱导
1、病毒诱导：如仙台病毒（Sendaivirus） ，主要用于动
物细胞融合。
2、电融合：用电融合仪诱导融合，主要用于植物细 胞。
3、聚乙二醇（polythyleneglycol，PEG）诱导：分 子量200－6000都可用，以1000较好。用于诱 导植物原生质体融合和多种动物细胞融合。 优点：材料易得、操作方法简单、效果稳定。
计数200个细胞计算异细胞融合率融合细胞核数占细胞核总数的百分率融合细胞核数100融合细胞核数未融合的细胞核数peg处理时间不宜过长否则会造成细胞破坏或有多个细胞彼此融合形成巨大的合经peg处理后加液混匀时应轻轻吹打以免刚刚融合的细胞分开
PEG诱导的细胞融合实验
细胞融合（cell fusion）
PEG法诱导细胞融合
PEG法诱导细胞融合PEG法诱导细胞融合是一种常用的细胞生物学实验技术，通过聚乙二醇（PEG）作为诱导剂，促进两个或多个细胞之间的融合。
这种方法常用于制备单克隆抗体、诱导染色体加倍、诱导基因转移等研究领域。
以下是PEG法诱导细胞融合的详细步骤和注意事项。
一、实验准备1.细胞株：选择需要进行融合的细胞株，可以是两种或多种不同种类的细胞。
2.培养基：选择适合细胞生长和繁殖的培养基，一般采用含10%胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养基。
3.聚乙二醇（PEG）：选择合适浓度的PEG，根据实验需求选择PEG分子量。
常用的PEG分子量有4000、6000、8000等。
4.抗体：选择适当的抗体进行融合后检测，如抗细胞表面抗原的单克隆抗体、抗细胞内抗原的单克隆抗体等。
5.仪器设备：细胞融合仪、显微镜、离心机、培养箱等。
二、实验步骤1.细胞传代：将待融合的细胞株按照常规方法进行传代，使细胞生长到对数生长期。
2.细胞洗涤：将传代后的细胞洗涤两次，去除培养基中的杂质和未贴壁的细胞。
3.细胞融合：将两种或多种细胞按照一定的比例混合在一起，加入适量的PEG，充分摇匀，使细胞充分融合。
4.细胞洗涤：将融合后的细胞洗涤两次，去除未融合的细胞和PEG残留。
5.细胞培养：将融合后的细胞接种到培养基中，加入适量的抗生素和生长因子，置入培养箱中培养。
6.检测和观察：在融合后的不同时间点进行细胞形态学观察和免疫学检测，如荧光染色、ELISA等方法，以评估融合效果。
三、注意事项1.细胞株的选择：PEG法诱导细胞融合适用于大多数动物细胞，但不同种类的细胞融合难度和最佳条件可能不同。
因此，在选择细胞株时需要考虑其种类、状态和生长特性等因素。
2.PEG浓度的选择：PEG浓度是影响细胞融合的关键因素之一。
不同浓度的PEG对细胞的毒性作用和融合效果也不同。
因此，需要根据实验需求和细胞特性选择合适的PEG浓度。
3.细胞的活性：在进行细胞融合之前，需要确认细胞的活性和数量。
PEG促细胞融合实验报告
PEG促细胞融合实验报告实验目的：通过PEG促细胞融合实验，探究细胞融合的原理和过程，以及利用细胞融合实验来研究细胞生物学和生物医学相关领域的应用。
实验原理：PEG（聚乙二醇）促进细胞融合是一种流行的实验方法。
PEG具有双亲性分子，在水溶液中既溶于水，又溶于脂质双层。
通过PEG融合神经元，可以融合细胞的细胞膜，使其形成一个大的细胞。
实验材料：1.神经元细胞系2.细胞培养培养基3.聚乙二醇（PEG）4.显微镜检查设备5.细胞培养相关试剂实验步骤：1.准备两个相同类型的细胞培养皿，将细胞预先培养至适当的密度。
2.将细胞培养基抽取掉，用无血清的培养基洗涤细胞。
并将细胞置于含有2g/LPEG的无血清培养基中。
3.轻轻撤离培养皿，将第一个细胞制备物转移到第二个相匹配的细胞制备物上。
4.将含有PEG的细胞悬液迅速转运到冷缓冲液中禁止PEG分子的扩散。
并禁止PEG浓度随温度变化引起细胞融合。
5.分离悬浮细胞，使用显微镜观察新形成的细胞结构。
实验结果与讨论：在经过实验之后，我们观察到了细胞融合的现象。
在尝试不同类型的细胞融合时，我们注意到不同类型的细胞在融合后可以形成具有新功能的细胞。
细胞融合可以通过PEG分子的作用，在较短的时间内实现细胞膜的融合。
PEG作为双亲性分子，能够同时溶解在水和脂质双层中，在融合时充当桥梁的作用。
实验的关键参数之一是PEG的浓度，不同浓度的PEG可能导致不同程度的细胞融合。
较低浓度的PEG可能只形成微小的细胞团，而高浓度的PEG则可能导致更大的细胞聚集。
细胞融合实验常用于细胞融合技术的开发和细胞混合实验的需要。
该技术可以应用于多个领域，包括研究免疫细胞抗原识别，细胞生物学和生物医学研究。
细胞融合的原理和实验方法的深入理解对于相关领域的研究和应用具有重要意义。
通过细胞融合实验，可以研究不同细胞类型之间的相互作用和交流，为细胞生物学和生物医学研究提供新的视角和手段。
综上所述，PEG促细胞融合实验是一种重要的实验方法，可以用于深入研究细胞融合的原理和应用。
实验二聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合
【结果观察】 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上 的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同 核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠 的鸡红细胞。
【结果观察】 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上 的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同 核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠 的鸡红细胞。
【实验报告】 l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细 胞融合各阶段，并注明主要特点。 2．什么是同核体、异核体? 细胞融合主 要有哪几种方法？简述细胞融合的应用。
【实验用品】 1．材料 鸡红细胞 2．器材和仪器：显微镜、离心机、水浴 箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖 玻片 3．试剂 Alsver液(pH7.4)、0.85％生理盐 水、GKN液、50％PEG（MW 4000） Nhomakorabea
【方法步骤】 1．采血及鸡红细胞悬液的制备（同教材57页）。 2．（共2组）取鸡红细胞悬液1mL，移人10mL离心管， 加入4mL 0.85％生理盐水混匀。1000r／min离心5 min。 3．弃上清液(用吸管吸去)，加0.85％生理 盐水5mL，用 指弹法（或吸管轻吹）将细胞团块弹散，混匀后1000r ／min离心5min；重复上述条件，再离心洗涤1次。 4．收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量（5－ 8mL）的GKN液，轻吹散，混匀。 5．（每4人）取悬液1mL到1个试管中，加入0.5 mL预 热的50％PEG混匀，置于30℃水浴中温浴3－5min；取 未融合和融合的血细胞悬液各1滴分别滴于载玻片上的 两侧，盖上盖玻片。 6．利用光学显微镜 (高倍) 以未融合细胞为对照观察2个 靠近细胞形成融合的过程。
实验二：聚乙二醇（PEG）介导 的细胞融合
【课前预习】 1．介导细胞融合的方法有哪些？ 2．细胞融合技术有哪些方面的应用？
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题目：PEG促细胞融合
一．实验目的:
1.掌握细胞融合的方法
2.学习使用PEG促进细胞融合的方法和步骤
二．实验原理
1.细胞融合：在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上
的细胞合并形成一个细胞的过程。
由于体外培养的细胞很少会发生自发融合融合频率大约在10−4-10−6之间，因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。
2.促进细胞融合的方法
a)生物方法：病毒（Sendai virus，Newcastle disease virus，Vaceine virus）
b)化学方法：聚乙二醇、盐类融合剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂
质、Ca2+配合物等。
PEG相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。
普遍认为
聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏
散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，
从而使细胞发生融合。
在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒
更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。
c)物理方法：电融合:电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，是
融合率大为提高。
电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。
而相对的脂
双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。
由于连接处的细胞膜表面曲率大，
处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆
形的大球状细胞。
与ⅣG法比较，电融合法融合率高：重复性强：诱导仅发生在
质膜接触部位，对细胞或原生质体伤害小：融合是在同步状态下进行，活细胞数目
多；装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录象融合过程：免去PEG诱导后的
洗涤过程，诱导过程可控制性强。
三．实验材料及设备
1.实验材料：
a)50%PEG混合液
b)鸡红细胞悬液
c)生理盐水
d)Hanks溶液
2.实验设备：
a)普通光学显微镜
b)载玻片若干，注射器
c)酒精灯、恒温水浴锅
d)离心管若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等
四．实验方法及步骤
1.制取鸡血红细胞悬液
2.取细胞悬液1mL，移入10mL离心管，加入4mL0.85%生理盐
水混匀。
1200r/min离心5min。
3.弃上清液（用吸管吸去），加0.85%生理盐水至5mL，混匀
后1200r/min离心5min。
重复上述步骤，再离心洗涤一次4.收集最后一次离心沉淀的血细胞，加入适量的Hanks液，
按压积红细胞体积的9倍溶液配成10%的红细胞悬液（浓度约为3-4万个/mL）
5.取上述悬液1mL到一个试管中，加入0.5-0.8mL预热的
50%PEG混匀，置于37℃水浴中温浴2min（再加入Ringer 或Hanks液5mL以终止PEG的作用；）
6.取悬液一滴滴于载玻片上，再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴，
盖上盖玻片。
7.利用光学显微镜观察两个靠近细胞或三个细胞形成融合的
过程进行多个视野的测定，统计平均融合率。
五．实验结果
图1光镜下不同融合程度的鸡血红细胞,100x
图2染色后观察到的多核鸡红细胞
图3多视野统计融合率，40x
在光镜下可见单个椭圆状的鸡血红细胞，在经由PEG处理后，互相接触的鸡血红细胞发生融合，可见相互接触的红细胞逐渐融合组成一个更大的细胞结构。
由于实验过程中PEG处理时间过长，且摇晃过度，所以可见大量细胞聚集而成的褐红色团块。
六．实验讨论
1.实验结论：
本实验使用PEG溶液处理鸡血红细胞促进其细胞融合，从实验结果可知，鸡血红细胞之间出现了不同程度的融合现象。
还出现了不同程度的融合现象，形成褐色团块。
2.讨论一：细胞融合方法主要有哪几类？各有何优缺点？
几类细胞融合方法的优缺点如下：
1.病毒介导的细胞融合：优点是对细胞毒性较小，融合细胞易于
存活；缺点为使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭
活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方
法。
2.化学介导的细胞融合：优点是操作简便、快速省时且融合效果
好；缺点为PEG对细胞有毒性，处理不好则会直接影响融合细
胞的存活率。
3.电激法：优点是对细胞无毒性，且操作简单；缺点为它除需要
电融合仪外，还要求实验人员接受一定的技术训练。
3.讨论二：本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？
为什么？
本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合；但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合方法进行融合实验。
4.讨论三：和其他同学比较，为什么出现了较多褐色团块？
影响PEG融合的因素还有哪些？
在加入PEG后，为了使PEG与细胞充分接触，过度摇晃离心管，导致被PEG破坏的细胞凝集，破裂，形成了大量褐色团块。
其他影响因素：
1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其
浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。
为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。
2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合
效果最好。
3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细
胞的毒害也就越大。
故一般将处理时间限制在1分钟之内。
本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。
4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故
细胞的融合效果也与温度成正比。
因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。
对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。
七．参考文献
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