拟南芥基因片段测试
转基因拟南芥中外源基因的Southernblot检测_芦春斌
研究报告 芦春斌 :转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern blo t检测
1. 2. 2 PCR引物 猪 α-乳清蛋白基因的引物序列参照文献 [ 9] 。
1. 2. 3 质粒 DNA 参照文献 [ 8]提取质粒 DNA, 测定浓度并计算纯
度后 , 为 PCR扩增模板 。 1. 2. 4 基因片段的 PCR扩增和 probe制备
转基因植物技术可以定向改造生物性状 , 其应用 打破了传统育种方式只能利用亲缘关系相近物种间的 基因来改造生物的局限 , 因此转基因技术可以以前所 未有的速度和能力 , 在短时间内实现改良动 、植物品种 的产量 、质量 [ 1 - 4] 。
获得具有优良性状的转基因作物新品种 , 首先必 须确保外源 目的基因以 预期设计 的方式高 效表 达 [ 5, 6] 。然而许多情况下 转基因的表达不可预测 , 也
植物 转 化 双 元 载 体 pCG-CB-L act 为 前 期 实 验 构建 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 基因组 DNA 提取
取 100 mg样品 (叶片或种子 )放在研钵中 , 加液氮 研磨成粉末 , 采用改进的 CTAB 法提取转基因烟草的 基因组 DNA [ 7] , F lurescent 定 量剂 盒 (B io-R ad 产 品 , 170-2480)对 DNA定量 。
拟南芥基因片段测试
植物叶的生长发育调节机制叶是植物进行光合作用的主要器官, 在植物生长发育过程中起着重要的作用[1]。
叶的发育是植物形态建成的一个重要方面, 与植物株型的形成密切相关。
探明叶的发育机理, 不仅能使我们更多地了解植物叶的发育机制, 而且能帮助我们通过生物设计对株型进行改良。
因此, 对叶发育机理进行深入的研究具有重要的理论意义和应用价值。
[2]叶由表皮( 表皮细胞、泡状细胞、气孔器) 、叶肉、叶脉组成[3]。
1.叶肉组织的发育：1.1叶肉组织结构及其特点叶厚度的增加会增强叶的机械稳定性，叶表皮是保护叶免受机械损害，还可阻止叶水分流失。
栅栏组织是主要的光合组织，其厚度及细胞层次影响到叶绿体的分布和光合作用的效率，叶脉对叶片起支撑作用。
叶肉是叶片光合作用的主要部位, 栅栏组织和海绵组织厚度、细胞层数及栅栏细胞的形态变化等组合的差异必然影响到叶绿体的分布和光合作用的效率[4]。
在叶的发育过程中,维管束下方的3个树脂道最先分化发育,然后,维管束内的原生木质部由近轴面向远轴面分化发育,同时原表皮下的一层薄壁细胞发育形成厚壁组织纤维,起支持幼叶的作用。
当木质部基本成熟时,转输组织和韧皮部以及副转输组织开始发育,[5]然后,叶肉组织有栅栏组织和海绵组织的分化,但栅栏组织不发达,多由一层细胞组成、稀 2 层以上,细胞形状呈短圆锥形、圆锥形至钟柱形、柱形,较规则、排列较疏松;海绵组织相对较发达,由多层细胞组成、细胞形状呈圆球形、长椭圆形、近球状多边形等极不规则,排列疏松。
下陷气孔或孔下室极大,通气组织发达。
[6]叶肉细胞是植物进行光合作用的场所，从叶肉组织的厚度来看, 原变种宽叶吊兰最薄, 园艺栽培变种金心吊兰靠近主脉的黄色条纹区最厚, 靠近叶缘的绿条纹区次之, 中间的淡绿条纹区最薄。
[7]绿色区越多光合作用效果就越好。
叶是植物光合作用和调节水分散失的主要器官，对逆境胁迫比较敏感。
叶片是植物对外界环境变化最为敏感的器官之一, 其特征变化被认为最能体现环境因子的影响[8]。
拟南芥基因组测序
拟南芥基因组测序历史
中国贡献
中国国家自然科学基金委员会已于
2001年快速启动“拟南芥全部转录调 控因子蛋白组学研究”重大国际合作研 究项目，2004年3月，研究取得了重 要进展：共克隆了44个拟南芥转录调
控因子家族中的1282个基因，获得了
拟南芥所有已知和预测的1864个转录 因子的序列。是世界上获得转录因子 基因最多最完整的国家。
拟南芥基因组计划
测序结果: 只剩下10Mb的中心着丝区DNA，因 为多重复序列所含基因很少，还未
全测出。
包含25498个功能基因组及其所对应 的 11000个蛋白质家族。
这是人类首次全部破译出一种高等
植物的全基因序列。
拟南芥基因组计划
红色是已测序部分 浅蓝色是端粒和着丝粒区域 黑色是异染色质区域 粉红色是rDNA重复区域
拟南芥研究历史
1988 年，Meyerowitz 实验室发表了拟南芥基因组的首个 RFLP 图谱。
拟南芥研究历史
在之后的几年中，在Plant Cell，Science等杂志上相继报道了 T-DNA 插入突变基因的克隆、基于基因组图谱的基因克隆。
这些突破使人们逐渐 认识到拟南芥作为实 验材料对植物生命进 行探索的价值。
拟南芥基因组最新研究进展
这篇论文展示了 1135 个拟南芥 自然近交系的基因组，发现拟 南芥祖先栖息地依然栖息着残 余群体，以及末次盛冰期对残 余群体分布的结构具有很重要 的影响。相信这些收集的拟南 芥基因组数据会在整个物种水 平上连接基因型和表型。 该篇论文的发表，宣告了 1001 基因组计划项目第一阶段的结 束。
谢谢
拟南芥基因组测序意义
能够更详尽的了解植物独特的代谢过程,。 了解植物与环境的相互作用以及它们的抗病和抗虫能力。 由于许多生理生化过程是十分保守的。因此可通过基因及基 因功能比较, 跨种甚至跨界的揭示生命活动的基本规律。 有助于理解DNA 的复制和染色体的分离过程, 并为基因工程 设计提供新的途径。 有助于人们对整个植物界的认识, 改善农作物的品质, 提高农 作物的抗逆性以及降低农业生产对环境的影响。
拟南芥实验报告
一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。
在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。
RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。
本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。
五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
8.2 拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定
拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定摘要利用T-DNA插入拟南芥基因引起突变，获得突变植株，提取16号植株细胞DNA，利用三引物法进行PCR扩增，检测得16号植株细胞内原基因与插入突变基因同时存在，为杂合突变体。
引言反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
T-DNA插入突变技术T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。
T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
植物材料——拟南芥拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：(1)植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；(2)生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；(3)自花授粉，有助于遗传试验的人工控制；(4)种子多，每株每代可产生数千粒种子；(5)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；(6)基因组小，只有5对染色体。
植物DNA提取——拟南芥
【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。
2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。
3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。
4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。
【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。
在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。
研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。
此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。
β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。
经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。
分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。
抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。
Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。
通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。
关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。
同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。
2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。
2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。