荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用
先进光学显微成像技术在生物医学中的应用
先进光学显微成像技术在生物医学中的应用随着科技的不断发展，光学显微成像技术在生物医学领域中的应用也越来越广泛。
先进的光学显微成像技术对研究细胞、组织的结构、功能和动态变化有着至关重要的作用。
本文将介绍一些先进的光学显微成像技术及其在生物医学中的应用。
一、光学相干层析成像技术（OCT）光学相干层析成像技术是一种利用红外光的干涉原理来对组织进行无创、不侵入性成像的技术。
OCT图像具有高分辨率和微观结构的可视化能力，可以为生物医学领域的研究提供大量的信息。
通过OCT技术，我们可以观察到生物组织内的微观结构，如眼睛、皮肤和血管等，而且不需要做任何样本制备的工作。
因此，在眼科、皮肤科、心血管医学等领域中，OCT已成为一种得到广泛应用的技术。
例如，OCT可以对糖尿病患者的视网膜进行眼底成像，从而监测糖尿病对视网膜的影响；同时，OCT也可以用于心血管疾病的诊断，如心血管斑块或冠状动脉闭塞。
二、荧光显微镜技术荧光显微镜技术是一种有着广泛应用的成像技术。
通过特殊的荧光性染料，在样品中将目标物标记成绿色、蓝色或红色等荧光标记物，然后将样品置于荧光显微镜中进行成像。
荧光显微镜技术在生物医学中的应用非常广泛，例如动态活细胞成像、病原体检测、基因表达研究、蛋白质交互作用分析等。
其中，动态活细胞成像一直是荧光显微镜技术的研究热点，因为它可以揭示细胞内复杂的动态过程。
例如，通过荧光显微镜技术，可以观察到血液中的白细胞如何在体内移动。
同时，由于荧光标记技术的出现，荧光显微镜技术也广泛应用于生物医学领域中病理学、细胞生物学、神经生物学、肿瘤学等方向的研究。
三、分子显微镜技术（SM）分子显微镜技术是一种新型的高分辨率成像技术，能够直接观察到分子水平的动态过程。
这项技术能够解决传统显微成像技术无法揭示的细节问题。
SM技术在生物医学研究领域中受到了越来越广泛的关注，因为它能够为研究者提供更准确的细胞信号通路及药物分子相互作用的信息。
例如，研究员使用SM技术研究神经元之间的互动作用，揭示神经网络的内部工作原理，以便在某些疾病的治疗中进行干预。
一体化荧光显微成像系统用途
一体化荧光显微成像系统是一种集成了光学、机械、电子和软件技术的高级显微镜系统，主要用于观察、分析和记录荧光标记的生物样本或其他具有荧光性质的物质。
以下是一些该系统的主要用途：
1. 生物医学研究：在生物医学领域，荧光显微成像系统被广泛应用于细胞生物学、分子生物学和神经科学等研究。
通过荧光标记，可以观察和跟踪细胞结构、蛋白质分布、细胞器运动等生物学过程。
2. 药物研发：荧光显微成像系统在药物研发中发挥关键作用，用于研究药物在细胞水平的作用机制、药效评估以及药物释放和分布的动态过程。
3. 医学诊断：荧光显微成像系统可用于医学诊断，例如通过观察组织标本中的荧光信号来检测癌症细胞或其他病理性变化，提高诊断的准确性。
4. 材料科学：在材料科学领域，荧光显微成像系统可以用于研究材料表面、结构和性质，尤其是对于荧光标记的纳米材料或生物材料的表征。
5. 环境监测：荧光显微成像系统也可应用于环境监测，例如通过荧光标记来追踪污染物在水体中的传播和分布，提供环境污染状况的实时监测。
6. 教育和培训：荧光显微成像系统在教育领域被广泛用于生物学和医学专业的教学和培训，为学生提供直观的观察和实验体验。
总体而言，一体化荧光显微成像系统在许多科学和应用领域都发挥着重要的作用，为研究人员和专业人士提供了强大的工具来深入理解和研究微观世界。
荧光寿命显微成像技术
荧光寿命显微成像技术荧光寿命显微成像技术（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，简称FLIM）是一种非侵入性的生物成像技术，通过测量物质荧光的寿命来获得关于分子结构、环境和相互作用的信息。
荧光寿命是指荧光分子从激发态退激到基态所需的时间，它受到环境因素和分子相互作用的影响，因此可以作为特征参数用于研究生物分子的动力学过程。
荧光寿命显微成像技术与传统的荧光显微镜相比，具有许多优势。
首先，荧光寿命不受荧光强度的影响，因此可以准确地测量弱荧光信号。
其次，荧光寿命可以提供关于分子的额外信息，例如分子的构象、聚集状态和与其他分子的相互作用等。
此外，荧光寿命显微成像技术还可以通过使用不同的荧光探针来标记不同的分子，实现多重标记和多通道成像，从而提高研究的信息量。
荧光寿命显微成像技术的原理是基于荧光分子的激发态寿命和退激过程。
当荧光分子受到激发光的照射时，部分荧光分子会被激发到激发态，然后在一定的时间内退激到基态并发射荧光。
荧光寿命的测量可以通过激光脉冲的时间分辨，或者使用连续激发光和时间分辨单光子计数器来实现。
通过对样品进行扫描，可以获得每个像素点的荧光寿命信息，从而构建出样品的寿命图像。
荧光寿命显微成像技术在生物医学研究中有广泛的应用。
例如，在细胞生物学研究中，荧光寿命显微成像技术可以用于研究细胞内分子的动力学过程，如钙离子的浓度变化、离子通道的活性调控等。
在分子生物学研究中，荧光寿命显微成像技术可以用于研究蛋白质的结构和功能，如蛋白质的折叠和聚集状态。
此外，荧光寿命显微成像技术还可以应用于药物筛选、细胞分化、肿瘤诊断和治疗等领域。
荧光寿命显微成像技术的发展还面临一些挑战和局限性。
首先，荧光寿命的测量需要高时间分辨率，因此需要使用高速激光和高灵敏度的探测器，这增加了设备的复杂性和成本。
其次，在实际应用中，荧光分子的寿命受到许多因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等，因此需要对这些因素进行校正和控制。
荧光显微镜技术在生物学中的应用
荧光显微镜技术在生物学中的应用荧光显微镜是一种基于荧光现象的显微技术，它能够将激发物质发出的荧光信号转化为图像。
这一技术的应用之一就是在生物学研究中，它已经成为了一项重要的工具。
荧光显微镜技术的发展，不仅解决了传统显微镜不能达到的任务，同时也使得很多原本不能检测的生物学现象得到了揭示。
荧光显微镜技术的应用荧光显微镜技术在生物学领域的应用主要包括以下几个方面：1. 活细胞观察由于传统显微镜观测需要对样本进行固定处理，因此观察过程中无法观察到活细胞的现象。
使用荧光显微镜，由于它不需要使用化学固定剂，因此可以观察到细胞内部的动态变化，如细胞分裂、细胞核运动等现象。
2. 瞬时生化反应荧光显微镜技术可以标记生化反应或细胞内物质，使其发出荧光信号，并在实时观察到这一过程。
这项技术可以大大缩短生化反应的运行时间，可以监测蛋白质、DNA和RNA等的合成，以及离子和分子等化学现象。
3. 染色体和DNA研究荧光染色体或质体是一种标记生物大分子的技术。
荧光染色体和DNA标记技术可以用于检测DNA复制、DNA拆解和DNA修复等活动。
DNA标记技术也可用于评估遗传变异，这有助于检测不良遗传信息和基因突变。
4. 免疫荧光荧光显微镜技术可以用于免疫荧光标记。
在这项技术中，荧光标记的抗原与细胞内特定蛋白结合，呈现荧光信号。
这项技术可用于检测蛋白质的具体位置以及其在细胞中的分布情况与移动轨迹。
荧光显微镜技术广泛应用于细胞内分子动力学研究、免疫荧光技术、荧光共振能量转移、荧光蛋白研究、单分子力学测量、3D显微成像等多个领域，成为现代生物学研究的必备技术手段。
未来发展趋势正如其他许多生物技术一样，荧光显微镜技术取得了许多突破，但仍有困难需要解决。
解决这些问题的方法是不断研究和创新。
荧光显微镜技术的未来发展趋势在于进一步减少噪声和提高显微镜解析度。
在生物学研究中，我们将看到更清晰、更准确的图像，并且我们将能够识别其所显示的微观结构和化合物。
显微成像技术与光谱分析技术在生物医学领域中的应用研究
显微成像技术与光谱分析技术在生物医学领域中的应用研究在近几年来，显微成像技术和光谱分析技术在生物医学领域中的应用研究已经取得了重大进展。
这些技术的发展使得我们可以深入探究生物系统的微观结构和分子机制，从而更深刻地理解生物学中的一些重要问题，例如致病微生物的传播和生物医药中药物分析等。
一、显微成像技术的应用显微成像技术是指对样品进行高分辨率的成像，从而可以观察到细胞和组织的微观结构。
目前应用最广泛的显微成像技术是荧光显微镜，该技术通过荧光标记的生物分子将微观结构的成像可视化。
荧光显微技术具有很高的灵敏度和分辨率，可以用于观察生物分子的分布、动力学过程和相互作用，例如通过荧光共振能量转移（FRET）技术监测分子间距离，观察细胞器的运动，以及实现活细胞内的蛋白定位等。
除了荧光显微技术外，还有一些其他的显微成像技术，例如电子显微镜和原子力显微镜。
电子显微镜是一种高分辨率成像技术，可以用于观察组织和细胞的超微结构，例如细胞内器官的形态和分布，以及细胞壁和细胞膜的结构。
原子力显微镜则可以用于研究质子泵和离子通道等生物分子的空间结构和功能。
二、光谱分析技术的应用光谱分析技术是一种用于研究物质结构和组成的方法。
常见的光谱分析技术包括拉曼光谱、红外光谱和紫外-可见光谱。
这些技术都可以用于检测和鉴定化合物，例如药物、环境污染物和生物分子。
拉曼光谱是一种基于样品的振动频率的成分分析方法。
通过扫描样品的拉曼光谱，可以获取样品分子的信息，例如分子的成分、结构和动力学特性。
红外光谱分析则可以通过样品吸收红外光谱的能量来检测样品的成分和组成。
这种技术非常适用于生物医学行业，能够说是生物医学领域中最常用的技术之一。
例如应用红外光谱分析技术可以对癌细胞进行分析，从而确定真正的肿瘤细胞口径和类型。
最后，紫外-可见光谱是一种用于检测有机物的常规方法，同样可以应用于药物的质量分析和生物分子的检测。
三、显微成像技术和光谱分析技术的结合应用这两种技术的结合应用可以有效地提高样品的分析效率。
光片荧光显微成像
光片荧光显微成像光片荧光显微成像（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）是一种先进的显微成像技术，特别适用于生物样本的三维成像。
这种技术通过将样本暴露在切面状的光片中，而不是传统的点对点扫描，来获得高分辨率的图像。
下面简要介绍这一技术的基本原理和应用：一、基本原理1.光片照明：LSFM使用薄的光片（通常是激光）垂直照射样本，只照亮一个细微的平面。
这样可以大大减少样本的光损伤和光漂白。
2.正交检测：采用的检测镜头通常与光片成90度角，这样可以同时实现高分辨率和快速成像。
3.荧光成像：样本通常被标记有荧光染料或荧光蛋白，当光片通过样本时，只有与光片相交的部分会发出荧光信号，从而被检测镜头捕捉。
二、应用1.生物医学研究：在细胞生物学、神经科学、发育生物学等领域，LSFM可用于观察活细胞、组织甚至整个生物体的三维结构和动态过程。
2.高通量成像：由于LSFM具有较快的成像速度和较低的样本损伤，适合进行大规模样本的快速成像，如组织切片、小型动物模型等。
3.组织工程：在组织工程中，可以利用LSFM观察细胞在三维结构中的生长、移动和相互作用。
4.药物开发：LSFM可用于药物筛选和毒理学研究，通过观察药物对细胞或组织的影响。
三、优势与局限1.优势：较低的光毒性和漂白；高速、高分辨率的三维成像；减少样本损伤；适合活体成像。
2.局限：设备复杂且昂贵；样本准备可能较为复杂；对于较大或较密集的样本，成像深度可能受限。
光片荧光显微成像技术的发展不断为生物科学研究提供了新的视角和工具，尤其在理解生物系统的复杂动态中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步，其应用范围和效能都有望进一步扩展。
生命科学中的荧光成像技术及应用前景
生命科学中的荧光成像技术及应用前景荧光成像技术是生命科学领域中重要的工具之一，它可以用来研究生物大分子的结构、功能和互作关系，还能用来研究生物现象的动态过程。
本文将从荧光成像技术的历史、原理、应用以及未来前景等方面来进行探讨。
一、荧光成像技术的历史荧光成像技术是受到早期显微镜的启发而产生的。
光学显微镜的改良使得生物显微镜学得以进入一个新的时代。
19世纪初，英国生物学家欧文发现了在紫外线照射下蛋白质会放出荧光的现象。
20世纪初期，德国化学家史蒂斯托夫发现了荧光分子的一种新型结构，并将其应用于奈米量子颗粒的合成。
二、荧光成像技术的原理荧光成像技术是利用分子在受到光照射后会发出的荧光来研究其结构和功能的一种方法。
其基本原理是利用荧光分子吸收光能后，在激发态上快速地失去能量，随后放出的光子所包含的能量与吸收时的能量不同。
这种能量差与荧光分子的物理化学特性有关，比如分子结构、溶液浓度、温度和pH等因素。
因此，在荧光成像技术中，可以根据样品处理前后所释放的荧光信号来研究样品结构和功能上的变化。
三、荧光成像技术的应用荧光成像技术在生物医学研究、遗传学、细胞生物学、分子生物学等领域中有着广泛的应用。
具体来说，它可以用来研究蛋白质多态性、蛋白质定位、蛋白质交互作用等，还可以用来研究DNA、RNA的定位和功能等。
1. 荧光成像技术在医学研究中的应用荧光成像技术在医学研究中有着广泛的应用，可以用来研究细胞生长、发育、转移、分化、逆转等过程中的荧光标记物分布情况，进行细胞分子显微学方面的研究。
比如基于绿色荧光蛋白（GFP）的技术，可以将GFP标记到特定的蛋白质中，再通过荧光成像技术来观察蛋白质结构和功能的变化。
此外，荧光成像技术还可以用来研究癌细胞的扩散和血管生成等方面。
2. 荧光成像技术在细胞生物学研究中的应用细胞生物学是研究细胞和细胞发育、分裂、死亡等过程的学科。
荧光成像技术在研究细胞生物学中也有着重要的应用。
比如利用荧光成像技术可以研究细胞内蛋白质、RNA等分子的分布情况和变化过程，进而探究细胞功能。
活体荧光成像技术在医学中的应用
活体荧光成像技术在医学中的应用随着科技的不断发展，医学技术也在迅速进步。
其中一个叫做“活体荧光成像技术”的新技术，已经引起了医学界的广泛关注。
这项技术是一种通过显微镜和特殊的成像技术来观察活体器官的技术。
在医学中有着广泛的应用。
本文将介绍活体荧光成像技术在医学中的应用。
1. 活体荧光成像技术是什么？活体荧光成像技术是一种通过显微镜和特殊的成像技术来观察活体器官的技术。
它是通过感光元件和软件程序来实现显微镜成像和自动化分析的。
这项技术可以将生物发光的能力转化为图像来帮助实现内部器官的显微检测和分析。
这项技术广泛应用于癌症和其他疾病的研究和治疗。
2. 活体荧光成像技术在医学研究中的应用活体荧光成像技术在医学研究中发挥着巨大的作用。
这项技术可以用于研究和识别疾病和异常细胞，包括癌症细胞、细胞转化、生理变化、代谢调节和发育等。
在癌症研究方面，活体荧光成像技术被广泛用于观察肿瘤血供、细胞转移和微观肿瘤发生等过程。
此外，活体荧光成像技术还可以用于观察器官、细胞分裂、自噬和细胞自我修复等现象。
3. 活体荧光成像技术在医学诊断中的应用除了在医学研究中的应用，活体荧光成像技术还可以用于医学诊断。
在肿瘤手术中，医生可以利用这项技术观察肿瘤情况和移除程度，帮助提高手术效果和治疗效果。
此外，这项技术也可以用于心血管系统、消化系统以及神经系统等器官的诊断。
4. 活体荧光成像技术的优势和挑战活体荧光成像技术具有许多优势。
首先，它是一种非侵入性的成像技术，无需切开、取样或注射药物，可以帮助减少手术风险和病人痛苦。
其次，这项技术可以将生物发光的能力转化为图像，实现了更为精细和全面的成像效果。
然而，活体荧光成像技术的应用也面临着一些挑战，如光线故障、成像深度受限等问题。
此外，该技术也需要更多的研究来提高其精度和可靠性。
5. 结论随着医学技术的迅速发展，活体荧光成像技术在医学界的应用前景备受关注。
这项技术在医学研究和诊断中均具有广泛的应用价值，可以用于疾病检测和治疗、手术指导和疗效检测等方面，使医学诊疗更加精准和安全。
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姓名：何青学号：1224143003 专业：生物医学信息技术荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用随着光电子技术，尤其是激光技术的发展，越来越多的现代显微技术迅速发展起来。
目前，通过激光光源以激发被测物体的荧光或者非线性光学现象从而获得高分辨率的成像的技术就有：激光共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、二次谐波显微成像技术以及拉曼光谱成像技术等。
通过能量密度比普通光源高数十乃至数百倍的激光可以激发被测物的各种非线性光学现象，而被测物内部不同组织、不同成分的部分将显示不同的光学性质（如激发光的强度或者波长不一样），从而将这些不同部分区分开来，提高了显微系统的分辨率。
荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用日益广泛，技术发展也突飞猛进，成为热门的研究领域，并发展了突破衍射极限的超高分辨率荧光显微成像系统[1]。
现就目前应用比较广泛的激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜进行介绍。
1 激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜是近年来发展较为迅速的无创诊断技术。
它以光学系统的共焦成像为基础，利用光扫描技术对样品进行无创动态测量，目前已经发展成为生物学和医学研究诊断的重要工具，在生物医学的各方面得到了广泛的应用。
1.1 激光共聚焦扫描显微镜基本原理如图1所示，激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，采用双针孔的结构以形成物像共轭。
激光通过透镜聚焦在焦平面上针孔形成点光源，并在物镜焦平面对样品逐点扫描,样品上的每个照射点在像焦平面的探测孔处成像。
进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像。
，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像。
逐点、逐行、逐面快速扫描成像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
图1激光共聚焦扫描显微镜基本原理示意图1.2激光共聚焦显微镜的应用领域激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。
既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等领域得到广泛应用。
激光共聚焦显微镜的具体应用领域包括：多重荧光影像 ( Multi-Color Fluorescence Imaging )3D 立体影像重建 ( 3D Reconstruction )3D 动态影像获取与分析 ( Dynamic 3D imaging )神经立体分布影像 ( 3D Neuron imaging )形态与动态分析 ( Morphology )次微米单晶荧光影像技术 ( Nano-crystal )多重荧光蛋白影像技术 ( Multi-Color GFP Imaging )细胞离子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging )长时间影像记录 ( Time-Lapse Recording )Z轴扫描与测量 ( Z-section and measurement )基因影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification ) 染色体多重荧光原色表现 ( Chromosome spectral analysis )活体胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo )穿透光影像 / 反射光影像材料表面分析 ( Surface and roughness analysis )材料显微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis )晶园分析 ( Wafer analysis )薄膜分析 ( Thin layer analysis )2 多光子激光扫描荧光显微镜近年来，光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(two-photon excitation，简称TPE)在共焦激光扫描显微镜(confocal laserscanning microscopy，简称CLSM)中的广泛应用⋯．随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展，现在人们已经能够比较容易地制造并使用双光子共焦激光扫描显微镜(two—photon laser scanning microscopy，简称TPLSM)，对样品在双光子激发后发出的荧光进行观察和三维成像．目前, 以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用, 为开拓新学科和促进科学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作用．利用双光子共焦激光扫描显微镜的特点揭示了许多新现象和新规律，展示了广阔的发展前景。
2.1多光子激光扫描荧光显微镜基本原理多光子激光扫描荧光显微镜在激光照射下，基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态，随后又弛豫到某一基态，同时以光子形式释放能量而发出荧光．这一过程就是通常的单光子激发情况．1931年，Maria G6ppert—Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个光子而成激发态，这种情况就是双光子激发过程．1961年，Kaiser等在CaF2：Eu”晶体中首次观察到了这种双光子激发现象．比如在单光子激发情形，NADH酶在350nm 的光激发下产生450nm的荧光，而在双光子激发情形，NADH酶则需同时吸收两个700nm 的光子才能产生450rim的荧光．这就是说，双光子技术可以使我们无需使用紫外光源就能达到检测紫外荧光探针的目的，由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比，因而与单光子激发的线性过程相比，双光子激发就需要很强的激发光强，这就使双光子激发具有很高的空间局域特点[2]。
图2 光子激发示意图2.2 多光子激光扫描荧光显微镜的应用领域多光子共焦激光扫描显微镜已延伸到各个研究和应用领域. 它能对处在自然状态下的样品进行三维无损观察,并能提高系统的分辨率和信噪比.利用多光子激发后材料性质的变化,还可以实现三维高度数据存储和三维任意方向的微细加工,具有很高的应用价值. 可以相信,随着与多光子共焦显微镜相关的机械、材料、激光技术等的进一步发展多光子共焦激光扫描显微镜将得到更大的发展和更广泛的应用.3 激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜的比较激光共聚焦显微镜是80 年代随着光学、视频、计算机等技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜。
自从1957 年马文·闵斯基在他的美国专利上首次阐明扫描共聚焦显微镜技术的某些基本原理, 激光显微镜技术得到逐步发展。
1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜, 它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或激光激发荧光探针。
能够得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,由于它采用激光作光源, 发射角小, 方向性好, 在发射光检测光路上放置了一个与入射光针孔共轭的检测针孔, 使焦平面的光可以通过检测针孔, 而来自焦平面上、下的光被阻挡在针孔的两边。
因此, 可得到高清晰度的图像。
目前, 激光共聚焦显微镜已发展到拥有12 通道, 0b ~ 360b 旋转扫描,配以微幼步进马达控制载物台的升降, 对样本进行无损伤光学切片, 获得其三维立体结构可在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、pH 值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化, 成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
但激光共聚焦显微镜存在如下问题: ( 1) 要求共聚焦即照明针孔与探测针孔共轭; ( 2)探针对样品深度的干扰; ( 3) 样本遭到光漂白作用和光致毒作用。
多光子激光扫描显微镜的应用使这些问题迎刃而解。
多光子吸收的历史可追溯到1931 年, 当时M1 G1Meier做出了高光强度下多光子吸收会发生的理论预断[ 3] , 1961年在贝尔实验室用脉冲红宝石激光器激发铕离子荧光时首次观察到双光子吸收, 1989 年在美国康奈尔大学W1 Denk、J1H1 Stricker 和W1W1Webb 制成第一台多光子激光显微镜。
此后, 多光子激光显微镜在生物医学领域发挥了重要的作用。
现将两者作简单比较。
（1）多光子激光扫描显微镜采用飞秒激光器, 其惊人的应用之一是敏感的生物结构现象, 它容许的峰值功率密度大于1011WPcm2, 比激光共聚焦扫描显微镜105WPcm2 要高许多。
激光共聚焦扫描显微镜采用可见光激光, 能量连续激发,多光子激光扫描显微镜采用波长较长的红外激光, 能量脉冲式激发, 红外光比可见光在生物组织中的穿透力更强, 因此多光子激光扫描显微镜更能解决生物组织中深层物质的层析成像问题, 扩大了应用范围。
（2）激光共聚焦显微镜是单光子激发, 在整个扫描焦平面以及扫描上下都产生荧光的激发, 采用与照明针孔共轭的探测针孔, 使焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 从而提高了显微镜的分辨率, 但与此同时, 在生物样品的整个扫描面及扫描面上下, 造成荧光大范围的激发, 从而导致整个组织的广泛漂白和光动力学损伤。
多光子激光扫描显微镜采用多光子激发, 这是一个非线性过程, 具有准确的定位特征, 也就是只有在焦点处的光子才能激发荧光分子, 光漂白和光损伤仅局限于焦点附近, 且有利于减少测试样品的自发荧光,这样可以对活细胞进行更长时间的观察。
（3）激光共聚焦扫描显微镜因为有荧光大范围的激发, 所以需要共焦针孔来选择荧光。
多光子激光扫描显微镜的荧光激发只发生在焦点, 不需共焦针孔选择荧光, 因此测量光路更加简单、可靠、有效, 设备简单易携, 故障率低。
（4）多光子激光扫描显微镜比激光共聚焦扫描显微镜具有更准确的定位, 因而保证了更高的三维分辨率, 使背景的干扰相对减少, 进一步提高了图像清晰度。
（5）多光子激光扫描显微镜的荧光波长远离激发光波长, 因此多光子显微镜可实现暗场成像。
（6）激光共聚焦扫描显微镜在生物医学方面经常应用于细胞内游离钙测量, 细胞内pH 测量、荧光原位杂交分析, 免疫组化, 膜的流动性, 胞间通讯等方面。
多光子激光扫描显微镜除具有上述功能外, 在以下方面有着更多的应用:在特制的培养皿上可杀死或移动不需要的细胞, 分离单层贴壁细胞, 在细胞生长表面作微区划分, 长时间观察细胞生长, 建立维护混合细胞体系, 进行肿瘤移植, 控制细胞生长速度,建立稳定的细胞系, 建立细胞原代培养, 进行药物筛选。