实验六 大肠杆菌营养缺陷型的筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
大肠杆菌营养缺陷型
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选陈瑞州201110424108一.实验原理以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如维生素）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株称为营养缺陷型。
常用的诱变法是紫外线照射诱变法。
但是，经处理后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细菌。
因为抗生素能杀死生长的细菌而对不生长的细菌没影响，而缺陷型菌株在基本培养基中不能生长，由此通过含有抗生素的基本培养基即可淘汰野生型细菌，保留缺陷型细菌。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后，将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上，凡是在基本培养基上不长，而在完全培养基上生长的菌落就是营养缺陷型。
二.实验材料大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌三.实验器具和药品1.用具：灭菌培养皿（9cm），灭菌三角瓶（150ml），灭菌离心管。
2.培养基1)肉汤液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水100ml，Ph7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。
2)肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水50ml，Ph7.2，高压灭菌锅15磅/英寸215分钟。
3)基本液体培养基：葡萄糖2g，蒸馏水98ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟4)基本固体培养基：琼脂2g，基本液体培养基100ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
5)无N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。
6)2N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.01g，(NH4)2SO4 0.2g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。
是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
物技术、微生物代谢等领域的研究中均具有重要作用，另外它还是研究基因的结构与功能的常用材料。该研
究以大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α为实验材料，利用紫外线（UV）对其进行诱变，并且采用青霉素法浓
缩营养缺陷型细菌，采用逐个测定法检出营养缺陷型，利用生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定、分析，得到了 4
株稳定的营养缺陷型突变株，分别为赖氨酸、组氨酸、精氨酸和嘧啶营养缺陷型菌株。
关键词：大肠杆菌；营养缺陷型；紫外诱变
中图分类号 Q311
文献标识码 A
文章编号 1007-7731（2016）15-0033-03
Study on Selection of Auxotrophic Strain of Escherichia coli by UV Mutation
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2016，22（15）
33
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
宁 祎 李基丽 道吉吉 王春台 刘新琼*
（中南民族大学生命科学学院，湖北武汉 430074）
摘 要：营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。营养缺陷型菌株在遗传学、食品生
Ning Yi et al. （College of Life Science，South-central University For Nationalities，Wuhan 430074，China） Abstract：The auxotrophic strain，which is caused by the gene mutation，is a kind of mutant strain of biochemistry. It plays an mportant role in the study of genetics，food biotechnology，microbial metabolism，and so on，besides， the auxotrophic strain has been always used to study the structure and function of genes. The steps of screening are inducing mutation，after culturing，eliminating the wild types，detecting the deficit types and identifying the deficit types.The ultraviole（t UV）was used to mutate the strain of Escherichia coli—DH5α，and then by the use of penicil⁃ lin method，the auxotrophic bacteria were concentrated and tested respectively to find out the auxotroph.Finally，the auxotrophies were identified and analyzed by growth chart of nutritional need，and four auxotrophic strains were suc⁃ cessfully obtained. Key words：Escherichia coli；Auxotrophy；UV-induced mutation
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要[目的]通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。
[方法]以大肠杆菌E.coli K12SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。
[结果]经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。
其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。
通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。
在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的DNA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。
一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。
本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。
此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。
在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。
当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。
如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型菌株的筛选过程
• 营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野 生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
• １诱变剂处理
• 诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变 处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很 低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素 法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌 株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。
3营养缺陷型的检出方法夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法影印接种法影印接种法逐个检出法逐个检出法1影印法影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上经培养后长出菌落然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具将长出菌落的平皿倒转过来在丝绒上轻轻按一下转接到另一基本培养基平板上经培养后比较这两个平皿长出的菌落
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法 • 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。
２）夹层培养法
• 夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。
实验5-营养缺陷型菌株筛选及鉴定
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
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实验六大肠杆菌营养缺陷型的筛选
一、实验目的
•1、学习掌握培养基的配制方法
•2、学习掌握消毒灭菌的原理与方法
•3、学习掌握紫外线诱变育种的方法
•4、学习掌握营养缺陷型的筛选方法
•5、学习掌握微生物接种及划线分离等基本技术，巩固加强无菌操作技术.
二、实验原理
•（一）培养基
•培养基（culture medium）：人工配制的供微生物生长或产生代谢产物的营养基质。
1、制备培养基的原则
•目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约
•1 ）根据营养类型设计培养基
•2 ）注意培养基中各种营养物质的浓度及比例
•3 ）适宜PH、氧化还原电位、水的活化度
•4 ）营养物质廉价易得
•5 ）灭菌：高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化
2、培养基类型
•1）物理状态：固体、液体、半固体
•2 ）、化学组份：天然或合成培养基
•3 ）、根据用途：
•A、加富培养基（enrichment medium）
•B、选择培养基（selective medium）
•C、鉴别培养基（differential medium）
（二）消毒与灭菌
•1、消毒、灭菌的概念
•2、灭菌的方法
(1)高温灭菌
火焰灼烧法：
干热灭菌
高烘箱热空气法：150—170℃，2h;
温
灭
菌巴氏消毒法：60—85 ℃，20min.
煮沸消毒法：100℃
湿热灭菌间歇灭菌法(丁达尔灭菌法)：
高压蒸汽灭菌：＞110℃
超高温瞬间灭菌135-150 ℃ 2-6S
高压蒸汽灭菌
相同温度下，湿热比干热灭菌效果好
•蒸汽存在潜热；
•蛋白质更易变性；
•湿热蒸汽穿透力比干热空气强；
微生物耐热性能
细菌内生孢子＞真菌孢子＞营养体
影响灭菌的因素
温度微生物种类；微生物的数量；培养基的体积；培养基的性质:浓度、PH
（2）辐射灭菌(radiation sterilization) 利用电磁辐射产生的电磁波进行灭菌的方法
紫外线：260nm效果最好；
电离辐射：X射线，γ射线；
可见光长时照射
（3）过滤除菌
（4）高渗作用
（5）干燥
（6）超声波
（三）诱变育种
•1、基因突变的概念
•2、自发突变与诱发突变
•3、常用诱变剂
（四）营养缺陷型
•营养缺陷型是由基因突变而丧失合成某种其生长所必需的营养物质的能力，必须在培养基中添加相应的营养成分才能正常生长的突变型。
它的基因型表示方法为：his C－his C＋，表型的表示方法为：HisC •营养缺陷型是一种负选择性标记（在选择培养基中不能生长），常用影印平板法进行分离
三、实验材料
• E.coli斜面菌种6支
•LB固体平板100个、基本培养基平板40个
•装有13.5ml PB的大试管3支、装有9ml PB的大试管3支
•装有50ml LB的250 ml三角瓶3支
•装有50ml 含有氨苄青霉素基本培养基的250 ml三角瓶1支
•装有4ml LB液体培养基的试管2支
•1ml移液管1支、10ml移液管6支、5ml移液管7支
•50ml离心管3支、15ml离心管2支
•培养皿2套、镊子2把、滴管2支、枪头60个、涂布器10支、牙签若干
•计数板、计数器、移液枪
四、实验内容及操作步骤
•（一）培养基的配制及材料灭菌
•LB培养基
•细菌基本培养基
•PB缓冲液
•氨基酸溶液（滤纸片）
•双蒸馏水950ml，胰蛋白胨10g，NaCL10g，酵母提取物5g，用1mol/LNaOH调节pH至7.0，加双蒸馏水至总体积
1000ml，121℃高压蒸汽灭菌30min
基本培养基
•NH4H2PO4 1g，MgSO4 ·7H2O 0.2g，葡萄糖5g，NaCL 5g，
K2HPO4 1g，水1000ml，pH7.0, 115 ℃灭菌20min
•含青霉素基本培养基：待LB培养基灭菌后冷却至50 ℃左右加入抗生素，至终浓度2000单位/ml
PB 缓冲液
•0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：秤取Na2HPO4·12H2O 35.82g，溶于1000ml蒸馏水中，为A液；秤取NaH2PO4·2H2O 15.605g，溶于1000ml蒸馏水中，为B液。
取A液61ml，B 液39ml，可得100ml0.1 mol/L pH7.0的磷酸缓冲液
（二）营养缺陷型的筛选。