DNA的酶切鉴定
酶切鉴定-BamHI and EcoRI
注意事项
1. 直接在抽提的质粒 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系 2. 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做 为使微量操作更精确，可以 个人 个人（ ）一起做9 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。 于各质粒管中。 份酶切 体系混合液，然后再分装 于各质粒管中 3. 上样时要小心操作，防止样品溢出。 上样时要小心操作，防止样品溢出。 4. 接触凝胶时，因其中含有EB或荧光染料，要戴手套， 接触凝胶时，因其中含有 或荧光染料 要戴手套， 或荧光染料， 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 5. EB是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物
限制性内切 酶切割DNA 酶切割
A: Strategy of construction
f1 ori Ampr pGEX Vector (4900 bp)
BamH I EcoR I
B: The product of PCR
1 2 3
4900 bp
X-gene cDNA
Primer1
740 bp
Primer2
体积（ ） 体积（µl） 10 2 1 1 1 5 20
酶切一小时后，每管加入 酶切一小时后，每管加入5 ul的6xloading 的 buffer，中止反应，混匀。 ，中止反应，混匀。 20~25 ul上样，在一个泳道中加入 ul DNA 上样， 上样 在一个泳道中加入10 Marker。 。
核酸电泳 根据核酸的解离性质， 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动， 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖 琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 凝胶电泳和 常用的凝胶电泳有琼脂糖 凝胶电泳 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 凝胶电泳。 酰胺 凝胶电泳 的电泳槽中进行。 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。 所以分离效率很高。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA 按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。
根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。
关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。
限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。
影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。
DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。
T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。
影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。
高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件
实验目的
1、学习限制性内切酶的特性 2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法
高中教材分析
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特
异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的
重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶
等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴 定。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺 序，并在识别点附近 1000 bp 的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专 一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技 术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结外观察 分析仪 上观察酶切的结果。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能 形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取 决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的 缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
BglⅡ
19
5) 影响内切酶切割效率的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。
质粒
EcoR1
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型和特征 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1)寄主控制的限制与修饰现象 restriction modification system
质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
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实验材料和试剂
实验材料： 玉米基因组DNA 实验试剂： • BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂 糖均可。
实验仪器
恒温水浴锅
实验步骤
EP管编号
反应体系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT 3μL
实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切
实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制 性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶可分为三类
限制性内切 酶 Ⅰ类
酶分子
识别位点
切割位点
限制作用是 否需用 ATP
Ⅱ类
三 亚 基 双 二分非对称 至少在识别 功能酶 位 点 外 1000bp 内切酶与甲 4-6bp, 大多 在识别位点 基化酶分子 数为回文对 中或靠近识 称结构 不在一起 别位点无特 异性 二亚基双功 5-7 bp 非对 在识别位点 能酶 称 下游 2426bp
2.
3.
4.
思考题
如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被酶切或者酶切不完全 , 你认为可能是什么
原因？
Yes
No
Ⅲ类
Yes
Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切 割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG3’ )；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出 末端的 DNA 片段称粘性末端，如 EcoR Ⅰ切割识别序列 后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
1.
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。 但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加 2-3倍，甚至更多， 反应时间也要适当延长。
酶切时所加的 DNA溶液体积不能太大，否则 DNA溶液中其他成分 会干扰酶反应。 许多实验制备的 DNA 不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应 液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质 可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应 缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实 验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10之下，否则酶活性将受影 响。
用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底
混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h
电泳检测
对质粒DNA酶切反应
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加 1单位酶 , 消化 1-2h 。但要完全酶解
则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚 至更多，反应时间也要适当延长。
电泳检测示例
实验注意事项