质粒提取及酶切鉴定
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质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
质粒提取定量与酶切鉴定
质粒提取定量与酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒提取,定量,酶切鉴定实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2018级临床卓越创新班组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2019-11-05 实验地点第四实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03一、实验目的1.学习并掌握碱裂解法提取质粒的方法2.掌握紫外吸收测定DNA的操作3.了解质粒酶切鉴定原理和方法4.掌握琼脂糖凝胶电泳技术原理，操作二、实验原理1. 碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
1）pH =12.6（碱性），染色体DNA：氢键断裂，变性。
质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
（不完全变性）2）（在1）溶液加入KAc溶液调节pH），中性，质粒DNA：复性，继续溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成了、缠连的网状结构。
3）离心后，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来2. 离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值的状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3. 质粒DNA定量测定：紫外光分光光度计法1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2）而且物质对光的吸收是具有选择性的3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱4）因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在紫外光260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。
5）DNA对波长260nm的紫外光有特异吸收峰，蛋白质在280nm紫外光处有特异吸收峰，A260/A280可以反应DNA纯度。
4.质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA5.琼脂糖凝胶电泳（有电荷效应，分子筛效应）不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动速率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA的提取酶切及检测
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管
醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条 件会打断DNA。
▪ 平衡酚：氯仿（1：1）
作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚 的比重略比水重，不利于含质粒的水相的 回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得 酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。
▪ 乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
▪ TE缓冲液：溶解DNA
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
四、实验结果与讨论
根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况以及酶切情况。
相关知识
基因工程又称DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内， 使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻 译、表达的操作
包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细 胞内的保持、转录、翻译表达等全过程
基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、 受体细胞
常用到的工具酶
限制性内切酶 连接酶 聚合酶 逆转录酶 DNA酶和RNA酶
平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’
切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来。
质粒DNA的提取与酶切电泳鉴定.ppt
8、彻底弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入 1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000 rpm离心2分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温开盖放置1015min，使乙醇挥发殆尽。
10、将沉淀溶于30-50μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中， 储于-20℃冰箱中。
5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒离心管5次，出现白色 沉淀，使沉淀混匀， 4℃ 12000rpm 离心10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混 匀，4℃下12000 rpm离心2分钟。
7、将上层水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混 匀后室温放置2分钟，然后4℃下12000 rpm离心5分钟。
2、取2 ml培养液倒入1.5ml EP管中（分次加入，离心）， 4℃ 12000 rpm 离心30s -1min，弃去上清；
3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。
4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，菌 液变得透亮，以混匀内容物（千万不要振荡）。
11、 酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。 （酶切体系一般1-2ul提取的质粒，10×buffer，相应的酶，余下加水， 一般鉴定所用的酶切体系建议10ul）
质粒提取关键：
基因组DNA与质粒DNA的有效分离 （碱裂解法）
高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白 质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性 成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状 不溶物质，从而可以通过离心除去。
注意事项:
实验方法
碱裂解法
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温开盖放置1015min，使乙醇挥发殆尽。
10、将沉淀溶于30-50μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中， 储于-20℃冰箱中。
5、加入350μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒离心管5次，出现白色 沉淀，使沉淀混匀， 4℃ 12000rpm 离心10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混 匀，4℃下12000 rpm离心2分钟。
7、将上层水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混 匀后室温放置2分钟，然后4℃下12000 rpm离心5分钟。
2、取2 ml培养液倒入1.5ml EP管中（分次加入，离心）， 4℃ 12000 rpm 离心30s -1min，弃去上清；
3、用涡旋混匀器使菌体沉淀重悬浮于250μl冰预冷的溶液Ⅰ。
4、加入新配制的溶液Ⅱ250μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，菌 液变得透亮，以混匀内容物（千万不要振荡）。
11、 酶切鉴定并将没有酶切的质粒与酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。 （酶切体系一般1-2ul提取的质粒，10×buffer，相应的酶，余下加水， 一般鉴定所用的酶切体系建议10ul）
质粒提取关键：
基因组DNA与质粒DNA的有效分离 （碱裂解法）
高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白 质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性 成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状 不溶物质，从而可以通过离心除去。
注意事项:
实验方法
碱裂解法
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了解DNA限制性核酸内切酶酶切 鉴定原理
质粒提取原理
质粒的提取主要是利用共价闭合环状质
粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在
碱性环境中，线性的大分子细菌染色体
DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然
状态；
溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠 （Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞 壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS） 处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上， 离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清 液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质 粒DNA。
Ⅱ型酶识别序列特点— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
钝性末端
粘性末端
掌握质粒DNA提取的原理与方法
（5）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混
匀，13 000 r/min离心2 min，300 μL上清液转
移至新的离心管中。
（6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室 温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液， 将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
（7）加入1 mL 70 %乙醇，震荡并离心， 13 000
分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基因工程技术中常用Ⅱ型 Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用，且识别及切 割位点不同（下游100-1000bp） Ⅲ型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割 位点不同（相距较近）
Ⅱ型限制酶特点
（1）识别及切割位点相同 （2）识别序列通常为4～8bp的回文结 构；
（3）切割可产生两类切口，三种末端。
Marker
质粒DNA过夜酶切
操作步骤(Methods)
分组：4人/组，每组提取两种质粒（空 载及重组质粒） 1.质粒的提取 （1）接种一个单菌落（single colony）
于5 mL含相应抗生素的LB培养基中， 37℃振荡培养至饱和状态（A600=0.4） 或过夜。（教师准备）
（2）取1.5 mL离心管一支，加入1.4 mL菌液， 13 000 r/min离心1 min去掉上清液。加入 150 μL 的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温 下放置10 min。 （3）加入200 μL新配制的溶液Ⅱ。加盖， 颠倒5次使之混匀。冰上放置5 min。 （4）加150 μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5 次混匀，冰上放置15 min。13 000 r/min离 心5 min，取400 μL上清液移入另一离心管 中。
具有自我复制功能。
带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物 经改造后具有多克隆位点。
质粒 (plasmid)
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状
限制性核酸内切酶：
概念 ------基因工程的手术刀
是分子生物学研究中的一种工具酶， 能识别DNA的特异序列, 并在识别位点或 其周围切割双链DNA的一类内切酶。
实验一 质粒提取及酶切鉴定
P158
相关基础知识
基因工程（genetic engineering） 是指采用人工方法将不同来源的
DNA进行重组，并将重组后的DNA引
入宿主细胞中进行增殖或表达的过
程。
基因工程相关物质
目的基因 工具酶 载体
质粒
存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型环状DNA分子(covalent closed circular DNA)。
由于操作原因，提取的质粒可有三种结构： 线形、开环、闭环超螺旋。
Relaxed circle Linearized form
Super-coiled form
质粒DNA酶切鉴定的原理
与DNA分子量标准物（Marker）比较能
大概判断未知DNA的分子量
质粒DNA为环状，在酶切彻底的情况下
，DNA片段数与酶切位点数目相同
如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC
HindⅢ：A↓AGCTT
作用
与甲基化酶共同构成细菌的限 制 修 饰 系 统 （ restriction-
modification system），限制外源
DNA， 保护自身DNA。
分类
酶结构、作用、识别及切割特异性的不同
r/min离心2 min，倒去上清液，晾干，加入20
μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。
2.质粒DNA的酶切鉴定
取一只1.5mL EP管加入以下试剂： 酶切混合液：15 μL 质粒DNA：5 μL
混匀后，置37 ℃过夜保温，反应源自结束后4 ℃放置备用。