质粒DNA的提取酶切及检测

质粒DNA 的提取、酶切及检测
相关知识
? 基因工程又称 DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内， 使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻 译、表达的操作
? 包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细 胞内的保持、转录、翻译表达等全过程
? 基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、 受体细胞
370C，190rpm振荡培养过夜 ?
取1.5菌液入1.5ml的dorf 管中
12000rpm、离心2s，弃上清，收集菌体 ?
100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）3min ?
加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置3min裂解菌体
? 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
常用到的工具酶
? 限制性内切酶 ? 连接酶 ? 聚合酶 逆转录酶 ? DNA酶和RNA酶
载体
结构的三大要素： ? 多克隆位点 ? 选择标记（耐药性） ? 独立的复制单位 种类： ? 质粒 ? 噬菌体 ? 酵母人工染色体（ YAC）
质 粒（plasmid）
? 是染色体外小型（ 1-200kb ）的共价、闭合、 环状的双链 DNA分子（cccDNA），能自主复制 并能稳定遗传的遗传因子。
Tris-Cl 控制溶液的pH ，葡萄糖使悬浮后的 大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 EDTA 是Ca2+ 和Mg2+ 等二价金属离子 的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要 作用是：抑制DNase 的活性，
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS ；
? NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，这是 由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊 结构的相变化所导致。SDS 是为下一步 操作做的铺垫。
? 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd 菌株用d，即Hind。
? 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于 这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都 是专一的。因此，这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识 别的专一核苷酸顺序最常见的是 4个或6个核 苷酸，少数也有识别 5个核苷酸以及 7个、 8 个、 9个、 10个和 11个核苷酸的。 II 型限 制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向 “读”都完全相同。这种酶的切割可以有两 种方式：
?
12000rpm，离心5min ?
沉淀用70%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） ?
12000rpm，离心2min ?
沉淀风干 ?
沉淀用20uL TE溶解，-200C保存
第二部分 质粒酶切
实验目的 Байду номын сангаас 理解限制性内切酶是DNA 重组技术的关
键工具 ? 掌握酶切的基本操作
实验原理
? 制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶 酶切，再经过 DNA 连接酶连接，便可获得携带 外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另 一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外 源基因产物。限制性内切酶是能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式 水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。
? 12000rpm ，离心5min，取上清记录体积到一新管
? 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（ 振荡混匀）
? 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
? （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（ 振荡混匀）
? 12000rpm ，离心2min，取上清记录体积到一新管
? 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），室温2min
? 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基 因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制 酶、修饰酶等
? 质粒的复制：严紧型复制（ 1~n个） 松弛型复制（ 20个以上）
实验目的和要求
学习和掌握质粒提取的原理与操作、 限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖 凝胶电泳的操作方法，并理解限制性 内切酶是DNA重组技术的关键工具， 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段 的有效方法。
?平衡酚：氯仿（1：1）
作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚 的比重略比水重，不利于含质粒的水相的 回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得 酚/ 氯仿始终在下层，方便水相的回收。
?乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
?TE缓冲液：溶解DNA
四、实验步骤
接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 ?
溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。
? 钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不 溶性的PDS ，而高浓度的盐，使得沉淀 更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉 淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大 肠杆菌的基因组DNA 也一起被共沉淀。 因为基因组DNA 太长了。
? 醋酸中和NaOH ，因为长时间的碱性条 件会打断DNA 。
? 而质粒DNA 则留在上清液内，其中还含有蛋白 质，实验中加入碱性酚（ pH8.0 ）和氯仿混合 液的抽提可以除去蛋白质。
? 含有质粒DNA 的上清液用乙醇沉淀，获得质粒 DNA 。
三、主要试剂
溶液I ，50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ；
粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。
第一部分 质粒DNA 的提取
碱裂解法
一、实验目的
?
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的
原理与操作。
二、实验原理
? 在EDTA 存在的条件下，经过 NaOH 和阴离子去 污剂SDS 处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体 充分的裂解。
? 此时，细菌染色体 DNA 缠绕附着在细胞膜碎片 上，离心时易被沉淀出来。
? EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列和切口是： EcoR Ⅰ:G ↓AATTC;Hind Ⅲ:A ↓AGCTT 。 G，A 等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示 酶切口。
限制性核酸内切酶的命名法
? 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如 E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。