实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
DNA重组技术试验报告
一、实验名称：重组DNA技术二、实验目的：1. 了解掌握DNA重组技术理论基础；2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；3.掌握连接产物的转化方法及操作；4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；三、实验原理：1.重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。
它主要包括以下几个步骤：①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。
cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。
常用于筛选编码蛋白质的结构基因。
基因组DNA 文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA 文库。
②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。
分为克隆载体和表达载体。
克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。
表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。
选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。
④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞（常用大肠杆菌），并使其获得新的表型的过程。
b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。
c、感染：以履菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切
子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。收集管中的溶液即为已纯化的 GAPDH基因DNA片段。
连接
• 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全 量为5 μl。
鉴定正反
• TA克隆有两种插入方式，造成正反向 • 常规PCR使得3’端多出一个A碱基
5’ nnnnnnnnnnA 3’ 3’ Annnnnnnnnn 5’
pMD®18-T Vector图谱
酶切鉴定
• 1. 建立酶切反应体系：
DNA
<=1μg
10Xbuffer2
3.0μl
10XBSA
3.0μl
• 42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会 被细胞吸收。
• 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗 传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可 筛选出转化子。
转化步骤
• 1. 于超净台中取连接产物10μl与100μl大肠杆菌感受态细胞 混合，置冰浴中30分钟。
C：溶液浓度(单位，mol/L) L：光路长度(单位，cm)
核酸纯度分析
• A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长 • A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估：
理论上，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的 A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳 香族）或酚类物质的污染，依据具体实验要求，考虑是否 纯化样品。
沉淀。 • 10,000g 离心1分钟，弃残液。 • 用500μl HB buffer 洗柱，10,000g 离心1分钟，去残液。 • 用700μl DNA wash buffer (乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1分钟，去
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定共37页
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
研究生实验三 重组质粒 DNA提取、双酶切鉴定
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
Thank you
பைடு நூலகம்
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
重组质粒鉴定
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
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②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
实验重组质粒DNA提6 取及双酶切鉴定
基因载体类型
质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC）
实验重组质粒DNA提9 取及双酶切鉴定
(2)质粒的三种构型
① 超螺旋DNA(SC DNA)
实验重组质粒DNA1提0 取及双酶切鉴定
② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋 转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
实验重组质粒DNA1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ1 取及双酶切鉴定
实验三
1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
实验目的
➢掌握质粒提纯的原理和方法; ➢掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学
会运用内切酶.
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
预习：基因克隆示意图
载体DNA ＋
(限制性内切酶切目 开的 ) 基因
＋
宿主细胞
重组体
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性
（DNA变性作用）
实验重组质粒DNA2提0 取及双酶切鉴定
溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
加1.4ml培养物于EP管，12000rpm×30S ①除去上清，再取1.4ml离心30s ②
除去上清，加入冰的100 µl溶液I，颠倒EP管，混匀
实 验步 骤及 注意 事项
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表 达 实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因克隆操作过程：
分
分离载体和目的基因
切
限制酶切载体与目的基因
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因载体（gene vector）
＊什么是基因载体
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术 ，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具
＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
基因载体应具备特点
1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因 大量扩增
2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达 能力）
(4)提取质粒DNA的目的与意义（？） 基因载体/基因克隆/基因工程
实验重组质粒DNA1提3 取及双酶切鉴定
2 提取质粒DNA的常规方法:
2.1 核酸分离纯化的总原则：
保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、
糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
加入200µl溶液II，温和混匀，冰浴3~5min 加入150µl冰溶液III，温和混匀，冰浴3~5min，12000rpm×5min ③
③ 线状DNA(linear DNA,L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
实验重组质粒DNA1提2 取及双酶切鉴定
(3)质粒DNA的一般特性：
①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
实验重组质粒DNA1提7 取及双酶切鉴定
④如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶 消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的 蛋白质。
实验重组质粒DNA1提8 取及双酶切鉴定
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成.
① 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用) ② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质
粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）
实验重组质粒DNA1提9 取及双酶切鉴定
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之