2010实验一二_重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法
一.质粒DNA的提取
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
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1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
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PUC119 （3.2Kb）
BamHI
双酶切
Hind III 重组质粒
BamHI 5'-G A A T T C-3‘ 3'-C T T A A G-5' Hind III 5'-A A G C T T-3' 3'-T T C G A A-5'
μl上样缓冲液，混匀 ）
电泳（100V 0.5小时，5V/cm）
染色与检测
（EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯下检测）
一、电泳前准备
准备内容 作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 3.根据DNA的分离范围选择合适的 胶浓度并记录
防止不必要的重复污染，减少外来 的污染。梳子干净有利于梳孔的 形成。
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）
1.1 定义
能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子 的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
U6启动子 （256bp）
电泳检测
2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
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2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定
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2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
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1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
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1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
2 实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE
10 加样缓冲液
EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，在波长为
254nm~365nm的紫外光照射下呈橘 红色（530nm）的荧光.
3 实验步骤
琼脂糖凝胶板的制备
（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4
排除电泳槽的电极接触不良，确保 buffer的缓冲能力，减少污染。 达到较好的分离效果，防止样过快 跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的 实验记录备查 用量记录，胶最终越薄越好。
二、制胶
注意事项 步骤 1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确
3.3 除去上清，加入冰的200 µ 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min l 实 加入200µ 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min l 验 步 加入150µl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 骤
转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min， 12000g×5min
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）
(2)细菌的收集与裂解 收集方法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
注意事项：
1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！！！
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1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
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(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的 瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引 起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右， 即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧， 缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定 的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头 赶掉气泡。 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产 生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入， 使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显； 不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动， 尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以 上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈 建议跑完胶之后再用EB染色。 过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。 时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影 响胶内部孔径形成。
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1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。
但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的。
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
4.室温凝胶30分钟
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
注意事项 步骤 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为 Loading buffer浓度不宜过低，点样时样 1 X，混匀 品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高， 电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰 坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起 时不要过猛带出样品。每点一个样完， 吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果 是有特殊要求，例如回收，强烈建议每 点一个样换一次枪头。加样的速度当然 是越快越好，注意保证质量。点样的量 不要太大，一方面是体积不要太大，溢 出污染邻位样品；一方面两不要太大， 容易导致脱尾和模糊不清。 胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。 跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出 胶等意外发生。
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
质粒DNA的提取及电泳
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保 存备用。
4. 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
四． 操作步骤
点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3. 制备1%琼脂糖凝胶。 （0.2克琼脂糖，加20毫升0.5倍的TBE） 4. 将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀， 轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要 避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 5. 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和 电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6. 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面 高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心 吸出，以免影响加样。
7. 将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。 8. 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9. 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～
1. 在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素（终浓度50微克/毫升）， 接入含PUC19的大肠杆菌，37度过夜培养。
2. 取1ml培养物入微量离心管中，室温离心12000转×30s，弃上清，将离心 管倒置，使液体尽可能流尽，将10毫升菌体收集在1个小指管中。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离
质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定一、实验目的1. 学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA 的方法；2. 学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3. 学习并掌握紫外吸收检测DNA 浓度和纯度的原理和方法；4. 学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5. 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1. PCR（多聚酶链式反应）在DNA 聚合酶催化下，可以DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCF一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至95C，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35-70C, —般低于模板Tm值的5C 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。
C. 延伸：溶液反应温度升至中温72C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2. 质粒DNA 的提取与制备（1）. 碱裂解法：染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒DNA 均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（2）.离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B. 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C. 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3. 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C. A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净A260/A280V1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
重组质粒DNA的提取、 酶切鉴定
1.0 ml
＋ 200l
悬浮液
细胞悬浮液（STE） 葡萄糖：提供等渗环境，增加溶液的粘度, 防止
DNA受机械作用而降解 Tris·HCl （三羟甲基氨甲烷） :
不含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性 EDTA(乙二胺四乙酸二钠):
螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制DNase保 护DNA；EDTA的存在,有利于溶菌作用。
温放置5min；
(3)加入200l细菌裂解液，颠倒混匀，待溶液变粘稠后，
立即进行下一个步骤； (4)加入150l中和液，上下颠倒混合后置冰上 5min，
12,000转/分，离心 5min；
(5)将上清移至另一管中,加入等体积的TE饱和酚/氯仿
(1:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 2min；
离心 2min
＋等体积TE
饱和酚/氯仿
移上清时要定量，不要混入白色沉淀物或漂浮物
饱和酚/氯仿(1:1)
！！带手套，一旦沾染皮肤请立即用大量清水冲洗！ 酚：使蛋白质变性沉淀 变性效果好，但与水部分互溶。
氯仿：可使蛋白质变性沉淀 变性效果没有酚好，但与水不相混溶。
离心后分层
上层水相含质粒 水相下面是变性蛋白 下层酚/氯仿
冰上 5min后 12,000转/分
离心 5min
移上层水相
于另一管中
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接提取质粒的操作流程及具体原理
（包括一些试剂的作用原理 ）
移上层水相
于另一管中
分层
＋等体积 氯仿/异戊醇
!!移上清时要定量，宁少勿多!
氯仿/异戊醇(24:1)溶液
氯仿：将残留在水相中的酚带走； 也可以再次使蛋白变性。
异戊醇：降低分子表面张力，减少气泡产生；
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：201000100122 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
分子医学实验：实验四 重组质粒DNA提取及双酶切鉴定1
Molecular medicine Skills
问题：
1.提取质粒DNA的目的？ 2.什么是限制性核酸内切酶？有何作用？ 3.为什么选用双酶切？
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时的三者泳动速度大小关系？
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Molecular medicine Skills
质粒DNA与宿主菌染色体DNA的区别：
宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA
要大得多
Escherichia coli. This organism was named for its discoverer, Theodore Escherich, and is one of the premier model organisms used in the study of bacterial genetics, physiology, and biochemistry. This enteric organism is typically present in the lower intestine of humans, where it is the dominant facultative anaerobe present, but it is only one minor constituent of the complete intestinal microflora. E. coli, is capable of causing various diseases in its host, especially when they acquire virulence traits. Strains of E. coli can cause urinary tract infections, neonatal meningitis, and many different intestinal diseases, usually by attaching to the host cell and introducing toxins that disrupt normal cellular processes. Virulence proteins may be encoded on extrachromosomal plasmids or within bacteriophages and distinct DNA segments termed pathogenicity islands (PAIs). PAIs are likely to have been transferred horizontally and may even have integrated into the chromosome through bacteriophage or plasmid
实验五-酶切鉴定-紫外分光光度检测DNA含量可编辑全文
二、制胶
步骤
注意事项
1.称量agarose和buffer
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的
瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引 起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
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产生误差的原因： 1.单色性不纯的影响； 2.杂散光的影响； 3.比色皿的影响； 4.温度、pH值的影响； 5.吸光度读数时的误差。
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2.4.2 实验步骤：
1. 0.1×TE 作 为 空 对 照 , 在 波 长 260nm 、 280nm 、 310nm处分别测标准DNA样品的OD值
2. 根据OD值计算DNA浓度（ g/ml）
二、紫外分光光度法检测DNA
2.1 分光光度技术
2.1.1 概述 分光光度技术是利用物质特有的吸收光
谱对其进行定性、定量分析的实验技术。
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2.1.2 特点
①灵敏度高：测定下限可达10－5～10－ 6mol/L
②准确度高：能够满足微量组分的测定要求， 相对误差2～5％ （1～2％）;
③操作简便快速; ④应用广泛。
用蒸馏水或溶剂作为“空白”校正反射光、 分散光，得： 入射光（I0）＝吸收光＋透过光（It）
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Lambert-Beer定律
D＝K C L
吸光度 摩尔消光系数 吸收物质的光径（cm）
溶液浓度（mol/L）
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2.2.3 分光光度法分析的依据： ①物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取
决于物质的结构，这就是分光光度法定性 分析的依据； ②其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这 是分光光度法定量分析的依据。