实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
实验二碱裂解法抽提质粒DNA2
3、加入1/10体积的3 M NaAc，加2倍体积的预冷无水乙醇，混匀。 4、置于-70oC冰箱约10分钟以上或-20oC冰箱30分钟至数小时。（DNA沉淀） 5、离心（12000 rpm，15分钟，4oC），倒掉乙醇，离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇
8、吸取 约500-600 μl 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质，若有杂质，则上清12000 rpm离 心5分钟后吸取上清）至另一 Eppendorf 管中；（记体积(tǐjī)）
9、加入 2/3 体积的酚/氯仿上下颠倒抽提10分钟，室温下静置待分层后12000 rpm 离心 10
分钟；（含有酚和氯仿的管子要盖好放于通风橱中）
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一、实验(shíyàn)目的
1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用；
2、掌握常用分子生物学试剂的配制；
3、掌握无菌操作技术； 4、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法；
5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；
6、学会(xuéhuì)根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。
详情请参考(cānkǎo)：
/p/1772289354
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碱裂解法的优缺点
优点：
1、对细菌的裂解、细菌染色体DNA及蛋白质变性充分；
2、提取的质粒DNA产量高、纯度好。
缺点：
1、碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，若暴露在强碱性环境 中时间过长，共价闭合环状质粒DNA发生不可逆的变性，导致酶切困难（电泳 时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是(jiùshì)此变性的质粒）。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
实验二重组DNA的提取及其酶切鉴定
实验二重组质粒的提取和鉴定一．提前一天扩增细菌(教师准备) 1．接种环；酒精棉球；火柴；酒精灯；记号笔；15 mL试管架；废物桶；2．15mL 离心管，内装5mL已加有100μg/mL 氨苄青霉素的LB液（共需40管）*请提前消毒45管内装5mL LB液的试管二．实验当天（一）每组（共40组）：1.饭盒内装： 1.5 mL Epp管×5纸巾×52．装冰的小盆；记号笔；镊子；废物桶；废液杯；3．1000、100、20 μL加样枪及枪头4．50 mL试管架和1.5 mL Ep管架5．一次性手套6．混匀板7．ddH2O×0.1 mL8．10×buffer 3uL（二）两组公用（共20套）：1．250 mL三角烧瓶(内装0.6g琼脂糖) 2．GelRed×6 μL3．1×TAE×500 mL 4．剪刀；电泳槽；梳子；量筒（三）全班公用（讲台上）*2份：1.AXYGEN 质粒小量制备试剂盒2.EcoR I酶3.Cla I 酶4.10×buffer5.λDNA Hind III Markers6.卷纸×4；保鲜膜（四）另外需：1.37℃水浴（内装1.5mL水漂）2.-20℃冰箱3.振荡器4.室温台式离心机5.低温15 mL离心机6.低温1.5 mL离心机7.电泳仪（两组共用）8.紫外检测仪（全班共用，在实验室讲台侧）（五）讲台上托盘中：1.电泳槽；胶布；混匀板；三角烧瓶2.公用试剂（冰浴）3.10 μL加样枪及枪头。
重组质粒鉴定
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
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实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。
实验材料及设备
pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤
A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提
挑取筛选平板上的白色菌落，
接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，
37℃振荡培养约12小时至对数生长后期
↓
取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清
↓
沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)），
剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟
↓
加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制)
盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，
以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟
↓
加入180 μl预冷的溶液III
（5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌）
盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀
↓
冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟
↓
上清液移入干净eppendorf管中，计算体积
↓
加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀
20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积
↓
加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟
↓
将上清移入干净eppendorf管中，计算体积
↓
加入2倍体积的无水乙醇
↓
混匀后置于-20℃冰箱中30分钟
↓
然后4℃下12000 rpm离心10分钟
↓
弃上清，将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出，
用70％乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次
↓
将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥
↓
将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0，（含20μg /ml RNaseA )中，储于-20℃冰箱中备用
B 双酶切反应
1、在PCR管中配制下列酶切体系（1×M Buffer）：
重组质粒10 ul（未稀释的原液）
ddH2O 6 ul
10×M Buffer 2ul
Xba I 1ul (15 U )
Pst I 1ul (15 U )
总体积20ul
2、反应管置37℃下，酶切反应3～4小时。
.
3、酶切反应产物的检测：反应管中加入6×溴酚兰载样缓冲液4 µl，混匀后于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，同时取8 µl DNA分子量标准DL2000于样品相邻孔中电泳,紫外光观察仪观察或凝胶成像仪照相。
根据分子量标准判断扩增产物大小和大致浓度。
本实验中预计酶切产物为844 bp。
C DNA琼脂糖凝胶电泳观察（同实验一）。