分子生物学实验 质粒的提取和酶切鉴定
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切
子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。收集管中的溶液即为已纯化的 GAPDH基因DNA片段。
连接
• 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全 量为5 μl。
鉴定正反
• TA克隆有两种插入方式，造成正反向 • 常规PCR使得3’端多出一个A碱基
5’ nnnnnnnnnnA 3’ 3’ Annnnnnnnnn 5’
pMD®18-T Vector图谱
酶切鉴定
• 1. 建立酶切反应体系：
DNA
<=1μg
10Xbuffer2
3.0μl
10XBSA
3.0μl
• 42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会 被细胞吸收。
• 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗 传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可 筛选出转化子。
转化步骤
• 1. 于超净台中取连接产物10μl与100μl大肠杆菌感受态细胞 混合，置冰浴中30分钟。
C：溶液浓度(单位，mol/L) L：光路长度(单位，cm)
核酸纯度分析
• A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长 • A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估：
理论上，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的 A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳 香族）或酚类物质的污染，依据具体实验要求，考虑是否 纯化样品。
沉淀。 • 10,000g 离心1分钟，弃残液。 • 用500μl HB buffer 洗柱，10,000g 离心1分钟，去残液。 • 用700μl DNA wash buffer (乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1分钟，去
109分子生物学实验技术简册(pdf56)(1)
分子生物学常用实验技术第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和cDNA合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组DNA的提取第七章 RFLP和RAPD技术第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
质粒的提取与鉴定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。
同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。
关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。
实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
《分子生物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告
《分⼦⽣物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告质粒DNA的提取与鉴定实验⽇期2020年5⽉14⽇室温25°C 成绩⼀、实验报告摘要【实验题⽬】质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定【实验⽬的】1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作⽤。
2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。
⼆、实验原理1、质粒：质粒是独⽴存在于染⾊体外，能⾃主复制并能稳定遗传的⼀种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及⼀些动植物细胞中。
细菌质粒是应⽤最多的质粒类群，在细菌细胞内利⽤宿主细胞的复制机构复制质粒⾃⾝的DNA2、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA⽚段的标准⽅法之⼀，该技术操作简便，快速。
⽤各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp⾄近50kb的DNA。
此外，直接⽤低浓度的核酸染料进⾏染⾊，可确定DNA在凝胶中的位置。
琼脂糖凝胶通常采⽤⽔平装置在强度和⽅向恒定的电场下电泳。
三、操作要点：（1）质粒DNA的提取1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加⼊2mL的塑料离⼼管(⼦弹头)内，每次以12000r/min离⼼1min(注意平衡)弃去上清液。
2、加⼊100uL⽤冰预冷的溶液I，⽤移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。
(溶液I放置冰中)3、加⼊200uL溶液II，盖紧盖⼝，翻转离⼼管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离⼼管置于冰上。
4、加⼊150uL⽤冰预冷的溶液III，盖紧盖⼝，翻转离⼼管，温和摇匀直⾄粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。
(溶液放置冰中)5、⽤微量离⼼机12000r/min离⼼5分钟。
取上清液移到另⼀离⼼管。
6、加⼊等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离⼼7分钟，将上清液收集到新的离⼼管中。
7、加⼊2倍体积100%⼄醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离⼼5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上⼲燥，漓尽液体。
8、⽤1m170%⼄醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空⽓⼲燥10min。
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
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质粒的分类与构成
• 克隆载体；表达载体 • 原核质粒；真核质粒
• 质粒的构成 -复制起始位点
-多克隆位点（含多个内切酶位点，用于外源基因插入） -选择性标记（抗性基因）
T7启动子，比大 肠杆菌RNA聚合 酶启动子强5倍 2. 多克隆位点C端含有myc表位 标签和His6标签。Myc标签和 His6标签与外源蛋白融合表达 ，可以用以亲和层析分离和 western blot
如何将质粒与细菌基因组DNA分开
利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过 程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。
去除蛋白质及其它杂质
基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不 同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂 质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的 纯化。
The concentration and purity of Plasmid
Plasmid/dsDNA: 1 OD260 = 50ug/ml
100% DNA: OD260/OD280 = 1.8
100% RNA: OD260/OD280 = 2.0
Question:
OD260/OD280 < 1.8 ? OD260/OD280 > 1.8 ?
Plasmid conformation variation leads to different migration
DL5Kb Marker
A
B
C
5000bp 3000bp
2000bp
1500bp 1000bp
750bp
A: cleavage plasmid B: linear plasmid C: superhelix plasmid
0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
0.3 0.6
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶
Agarose gel electrophoresis identification
Marker A B C D
BamH I EcoR I
6000bp 5000bp 2000bp 1000bp
提取步骤
1.5ml 菌液 重复3次 10000g离 心1min 250ul P1 吹打 250ul P2
沉淀
500ul 平衡液BL 350ul P3
溶液清亮粘稠
12000g离 心10min
上清 白色沉淀
12000g 离心 1min 重复1 次PW
12000g 离心 1min
CP3 柱
600ul PW
质粒提取：碱裂解法
基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差 异而达到分离目的。 pH =12.6（碱性）
染色体DNA：氢键断裂变性。
pH=中性
质粒DNA：复性，溶于溶液中
质粒DNA：大部分氢键断裂， 染色体DNA：不能复性；形成缠连 但超螺旋共价闭合环状的两 的网状结构。 条互补链不会完全分离。 （不完全变性） NaAc溶液（pH4.8） 离心 染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来
CP3柱开 盖2-5min
50ul EB 静置 2min
12000g 离心 2min
pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液） 1、吸取1.5ml过夜培养的细菌于Ep管中，10,000rpm 离心1分钟，小心吸弃上清 重复两次操作，共获得 4.5ml过夜培养的细菌。 2、加入250ul溶液P1（含RNase A）于Ep管中，移液 枪吹打悬浮细菌。 3、加入250ul溶液P2，温和地上下翻转混合6次 （2-5分钟）。 4、加入350ul溶液P3，轻轻混合6次，室温静置2分钟 。 5、12,000rpm离心10分钟，小心吸取上清加入吸附 柱中。 (可选步骤：吸附柱实验前加500ulBL平衡液， 12,000rpm离心1分钟后倒弃收集管内液体)
质粒DNA的酶切分析操作 在一个洁净的0.2 ml离心管中混匀下列反应物：
反应物 体积（µl)
bufferMC
质粒DNA
2
15.8( µl)
BamH I
EcoR I BSA
1
1 0.2
混合后37 ℃水浴1h
三 、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
线性DNA分子大小 （kb） 5～60 1～20
pCDNA3.1/myc-His-IFT57重组质粒: 6475bp pCDNA3.1/myc-His：5497bp (讲义上错误) IFT57基因（intraflagellar transport 57，鞭毛内运输蛋 白)：1270bp
酶切位点：BamHI:G^GATCC 920bp
EcoRI : G^AATTC 941bp
The extraction and
endonuclease cleavage of plasmid 质粒的提取和酶切鉴定 huang chunhong
掌握质粒DNA提取的原理与方法
了解DNA限制性核酸内切酶酶切 鉴定原理
质粒为环状双链DNA，它是染色体DNA之外 的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中，并 常用于DNA重组，用于外源基因的克隆和表达。
7.核糖体结合 位点：53005304bp
3.Pcmv 巨细胞疱疹病毒启动子
4.BGHpA,牛生长因子polyA 5.SV40 猴空泡病毒 SV40pA 猴空泡病毒polyA 6. pUC ori复制起始位点 f1 ori 噬菌体复制位点，能产 生单链DNA，可用于测序
1. 氨苄青霉素抗性， 新霉素抗性。
pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液） 6、12,000rpm离心1分钟，弃流出液。 7、加入600ul溶液PW，12,000rpm离心1分钟，弃 流出液。(重复1次) 8、12,000rpm离心2分钟，彻底去除残留的PW。 9、将吸附柱置于一干净的1.5ml Ep管中，在柱的 中央加入30-50ul EB（pH>7.0），室温静置1分钟。（EB在60-70℃ 水浴预热，使用效果更好 10、10,000rpm离心1分钟，洗脱质粒DNA待用。
• 溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium
dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴 离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎 片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。
• 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris-Cl(pH8.0)， 10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。 • 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。 • 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰 醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
pcDNA3.1/ myc-His A 5.5kb
Insert fragment: 1270bp
750bp
琼脂糖凝胶电泳上样
-123源自4每组上2个样品1：DNA Marker（10 l） 2：提取的质粒DNA （10 l）
3：质粒DNA酶切产物 （20l）
+
Loading Buffer 上样缓冲液 组成 • • • • EDTA 甘油 ……………增大溶液密度 溴酚蓝…………指示剂 二甲苯胺蓝……指示剂
• 提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。
The principles of plasmid extraction 质粒抽提： 即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分 开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯 净的质粒。 如何去除 RNA 使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。 经过 RNase 消化后，RNA 变得比较小了， 其残留对酶切反应几乎没有影响。
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中， 迁移率 溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝=4kbp
结果分析
M 1 2 3 4 5 6
M：1kbDNA Mark 1: 酶切前质粒DNA 2-6：酶切后产物
NCBI
PUBMED