实验三 质粒DNA的酶切鉴定

5. 酶切消化反应的时间和温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
酶
Apa I Bcl I Mae II Taq I
最适温 度oC 30 50 50 65
酶
Apy I BstE II Mae III
最适温 度oC 30 60 55
酶
Ban I Mae I Sma I
Baቤተ መጻሕፍቲ ባይዱHI
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
BglⅡ
Sau3A
部分同裂酶的切割位点
Enzyme Acc65I AhaIII Sequence GGTACC CCATGG
T T TAAA
Isoschizomers Asp718 I, Kpn I Dra I
BstMA I
EcoRI NdeI
限制性内切酶分类
• I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在 DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序 列相距1 000 bp的位置上随机切割。 l型限制酶对体外重组 DNA实验没有多少用处。 • III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其 酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以 产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。 • II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回 文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是 基因工程中主要使用的酶类。
同列裂酶和同尾酶 （1）同裂酶（Isoschizomers)
同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也 可以不同，来源不同的酶。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
部分同尾酶切割位点
Enzyme Sequence Isoschizomers BamHI 5’-GGATCC-3’ Bcl I, Bgl II 3’-CCTAGG-5’ Bcl I 5’-TGATCA-3’ BamH I, Bgl II 3’-ACTAGT-5’ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
分子生物学实验 Experiments of molecular biology
实验三 质粒DNA的酶切鉴定
授课教师：田生礼
实验三 质粒DNA的酶切鉴定
【目的要求】 1．了解一般限制性内切酶的特性； 2．学习设计酶切方案的一般规律,载体与供体进行酶切 ； 3．掌握酶的保存与使用方法；
【实验原理】 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有 I型、、II型、III型三类， II型限制性内切酶识别含4－8个 核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内 或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链 突出端（粘性末端）的DNA片断，常用于基因克隆的载体 切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内 切酶都不常用。
1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙 醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
Bgl II
Pst I Nsi I
5’-AGATCT-3’ Bcl I, BamH I 3’-TCTAGA-5’
5’-CTGCAG-3’ Nsi I, 3’-GACGTC-3’ 5’-ATGCAT-3’ Pst I 3’-TACGTA-5’ 5’-ATGCAT-3’ 3’-TACGTA-3’
影响限制性内切酶活性的因素
基因工程中必须使用甲基化酶失活 突变的菌株。
3. DNA的分子结构
DNA的分子结构有三种 超螺旋结构、线性结构、单链开环结构 对不完全消化具有一定的影响
4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
5’ -U GATCY3’ Xho Ⅱ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新 位点一般不能再被原来的酶识别。
BamHI
？
5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
BglⅡ
使用的时候要特别注意！
EcoR I和BamH I等都有*活性。
EcoR I： GAATTC 在低盐、高pH（>8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等
限制酶酶切反应的终止
大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。
37度水浴1个小时
酶切电泳图
M：DL5,000 DNA Marker；1：质粒DNA；2单酶切质粒 DNA（BamH I）；3：双酶切质粒DNA（BamH I和Xho I）。
• 影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实 验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间 与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。 • 酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总 体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确 定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较 好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL 。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+ 酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都 要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，离 心后保温酶切。
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I
5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
Asp718I 5’-G GTACC-3’ 3’-CCATG G-5’ Kpn I 5’-GGTAC C-3’ 3’-C CATGG-5’
限制性内切酶的识别序列
限制酶特点： 1.识别４-8个相连的核苷酸，以6个多见；
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Not I 5’-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCG-5’
EcoRI
2.呈回文结构(palindrome)； 5’-GAATTC-3’ 3.旋转对称性； 3’-CTTAAG-5’ 4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。 Fok I 5’-GGATGNN -3’ 3’-CCTAC NN-5’ 外侧，产生3’-端突起 5. 识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后， 不能被切割。
AAATTT CTGCAG GACGTC GAATTC CTTAAG CATATG GTATAC GCTAGC CGATCG GCGGCCGC CGCCGGCG CCCGGG GGGCCC
Pst I
Fun II FauND I
NheI
NotI SmaI
AsuNH I, Bmt I
CciN I Cfr9 I, PspA I, Xma I, XmaC I
限制性内切酶的切割方式
内切酶切割后产生的三种末端
a) 5’ 突出的粘性末端 如, EcoR I 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’
b) 3’ 突出的粘性末端 如, Pst I 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’ c) 平末端 如, Sma I 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
最适温 度oC 50 45 25
6. 反应体积和甘油浓度
质粒酶切鉴定通常设定反应体积为10-20μl,
质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为80100μl。
限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切 时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有 抑制作用。
7. 星号（*）活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在 一定的温度、离子强度、pH等条件下才 表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性 和切割效率，称为星号（*）活性。
【实验器材】 台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL） ,1.5mL Enpendorf管。 【实验材料】 限制性内切酶（ BamH I和Xho I ）及酶切缓冲液、无菌水，质粒DNA溶液。 【实验内容】 1．酶切有关基础知识介绍： 2．小量酶切，电泳鉴定。 3. 酶切体系的建立： 成分 质粒（T-AD） 10X缓冲液 去离子水 BamH I Xho I 总体积 单酶切 10 2 7 1 --20ul 双酶切 10 2 6 1 1 20ul
（2）同尾酶(Isocaudamers）
同尾酶 ( Isocaudamers ) :识别的序列不同，但能切出 相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等
5’ -G GATCC3’ BamH I 3’-CCTAGG-5’ Bgl Ⅱ Bcl I 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’