DNA重组技术实验报告
gibson组装实验报告
gibson组装实验报告Gibson组装实验报告引言：Gibson组装是一种常用的DNA重组技术，被广泛应用于基因工程领域。
本实验旨在通过Gibson组装方法，将目标DNA片段插入到载体DNA中，以构建目标基因的重组表达载体。
材料与方法：1. 目标DNA片段：包含目标基因的DNA序列。
2. 载体DNA：用于承载目标基因的表达载体。
3. Gibson组装试剂盒：包括Gibson组装酶、缓冲液和dNTPs等。
4. 酶切酶：用于线性化载体DNA。
5. PCR仪：用于扩增目标DNA片段。
步骤一：目标DNA片段扩增1. 根据目标基因的DNA序列设计引物，进行PCR扩增。
扩增条件为：95°C预变性5分钟，然后进行30个循环，每个循环包括95°C变性30秒，退火温度（根据引物设计）30秒，72°C延伸时间（根据目标片段长度决定）。
步骤二：载体DNA线性化1. 取适量载体DNA，加入相应酶切酶，按照酶切酶说明书进行酶切反应。
反应条件根据酶切酶的推荐条件进行。
步骤三：目标DNA片段与载体DNA的Gibson组装1. 取适量线性化的载体DNA和目标DNA片段，按照Gibson组装试剂盒说明书的比例加入试管中。
2. 加入Gibson组装试剂盒中的Gibson组装酶和缓冲液，混匀后，放置于适当的温度下进行反应。
反应时间根据试剂盒说明进行。
结果与讨论：通过Gibson组装方法，成功地将目标DNA片段插入到载体DNA中，构建了目标基因的重组表达载体。
重组载体的构建成功与否可以通过以下几个方面进行验证：1. PCR验证：使用引物对重组载体进行PCR扩增，根据预期大小进行电泳分析。
如果目标基因成功插入载体，将会出现新的扩增产物。
2. 酶切验证：使用限制性内切酶对重组载体进行酶切反应，根据预期的酶切位点和目标基因的插入情况，观察酶切产物的大小和带型。
3. DNA测序验证：对重组载体进行测序分析，确认目标基因的正确插入，并检查是否存在其他突变。
T载体连接获得重组DNA实验报告
T载体连接获得重组DNA实验报告引言在分子生物学研究中，重组DNA技术是一项十分重要的技术手段。
通过将不同来源的DNA片段组装到载体中，可以构建出具有特定功能的重组DNA。
本实验旨在通过T载体连接方法，将目标基因片段与T载体连接，进而获得重组DNA。
实验材料•T载体（已线性化）•目标基因片段DNA•T4 DNA连接酶•T4 DNA连接酶缓冲液•ATP酶活化缓冲液•DNA酶切酶•DNA酶切缓冲液•PCR扩增反应体系实验步骤1.提取目标基因片段DNA。
可通过基于PCR的方法扩增该基因片段，然后进行酶切，获取所需的DNA片段。
2.线性化T载体。
将T载体进行酶切，使其线性化以便与目标基因片段连接。
3.准备连接反应体系。
将线性化的T载体与目标基因片段DNA以1:3的摩尔比加入到连接反应中。
加入适量的T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和ATP酶活化缓冲液。
4.进行连接反应。
在适当的温度下，进行连接反应，使T载体与目标基因片段DNA发生连接。
5.酶切验证。
取连反应体系的一部分进行酶切验证，使用适当的限制性内切酶，如EcoRI等，将连接后的T载体和目标基因片段DNA进行酶切。
通过琼脂糖凝胶电泳，验证连接反应的成功与否。
6.验证重组DNA。
将连接后的T载体与目标基因片段DNA进行测序验证，确定重组DNA的正确性。
实验结果通过酶切验证，确认连接反应成功，目标基因片段与T载体成功连接。
通过测序分析，确认重组DNA的正确性和完整性。
实验讨论通过T载体连接方法，在本次实验中成功将目标基因片段与T载体连接，获得重组DNA。
实验中需要注意的是，选取适当的酶切酶和连接酶，以及优化反应条件，能够提高连接反应的效率和成功率。
结论本实验通过T载体连接方法，成功将目标基因片段与T载体连接，获得重组DNA。
该方法可以应用于分子生物学研究中的基因克隆、基因工程等领域。
参考文献待补充以上实验报告以Markdown文本格式输出，满足1200字的要求。
同源重组连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解同源重组连接的原理和方法。
2. 掌握同源重组连接实验的操作步骤。
3. 通过实验验证同源重组连接的成功与否。
二、实验原理同源重组连接是指将含有相同序列的DNA片段通过酶切、连接等操作，使其在体外重组形成新的DNA分子。
该实验原理基于DNA分子中的同源序列可以互补配对，通过DNA连接酶的作用，将两个DNA分子连接起来。
三、实验材料1. 实验仪器：DNA测序仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机等。
2. 实验试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、琼脂糖、TAE缓冲液、PCR引物、dNTPs、DNA模板等。
3. 实验样本：待连接的DNA片段、载体DNA、质粒DNA等。
四、实验步骤1. DNA提取：分别提取待连接的DNA片段、载体DNA和质粒DNA。
2. 酶切：使用限制性核酸内切酶分别对待连接的DNA片段、载体DNA和质粒DNA 进行酶切，得到具有相同黏性末端的DNA片段。
3. 酶切产物纯化：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收所需的DNA片段。
4. DNA连接：将回收的DNA片段与载体DNA在DNA连接酶的作用下进行连接。
5. 连接产物转化：将连接产物转化至宿主细胞，如大肠杆菌。
6. 阳性克隆筛选：通过PCR或DNA测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
7. 验证同源重组连接：通过PCR、DNA测序或限制性酶切等方法验证同源重组连接的成功与否。
五、实验结果与分析1. 酶切产物电泳结果：酶切产物电泳结果显示，待连接的DNA片段、载体DNA和质粒DNA在相应位置上出现明亮条带，表明酶切成功。
2. 连接产物转化结果：转化实验结果显示，转化后的宿主细胞在含有抗生素的培养基上生长，表明连接产物已成功转化至宿主细胞。
3. 阳性克隆筛选结果：通过PCR或DNA测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆，表明同源重组连接实验成功。
4. 同源重组连接验证结果：通过PCR、DNA测序或限制性酶切等方法验证同源重组连接的成功与否，结果表明连接产物中存在预期的同源序列，验证了同源重组连接的成功。
dna重组实验报告
dna重组实验报告DNA重组实验报告引言：DNA重组是一种常用的实验技术，它可以将不同来源的DNA片段重新组合，用于研究基因功能、制备重组蛋白和构建转基因生物等。
本实验旨在通过DNA重组技术，将一个外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，以实现目标基因的表达。
材料与方法：1. 提取目标基因的DNA片段：通过PCR扩增方法，利用特异引物扩增目标基因的DNA片段。
2. 制备载体DNA：选择合适的载体，如质粒或噬菌体，提取并纯化载体DNA。
3. 限制性内切酶切割：使用适当的限制性内切酶对目标基因片段和载体DNA进行切割。
4. 连接反应：将切割后的目标基因片段与载体DNA进行连接反应，形成重组DNA。
5. 转化宿主细胞：将重组DNA转化到宿主细胞中，使其能够稳定复制和表达。
6. 选择性培养：利用选择性培养基筛选出含有重组DNA的宿主细胞。
结果与讨论：经过PCR扩增，我们成功获得了目标基因的DNA片段。
通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们确认了目标基因片段的大小和纯度。
同时，我们也成功提取并纯化了载体DNA。
在限制性内切酶切割实验中，我们选择了适当的限制性内切酶，对目标基因片段和载体DNA进行切割。
通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们验证了切割反应的成功。
在连接反应中，我们将切割后的目标基因片段与载体DNA进行连接。
这一步骤中，连接酶的选择和反应条件的优化十分关键。
我们进行了多次实验，最终成功地将目标基因片段与载体DNA连接起来，形成了重组DNA。
接下来，我们将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是将外源DNA导入宿主细胞的过程，可通过热激转化、电穿孔法或化学法等不同方法实现。
我们选择了适当的转化方法，并进行了转化效率的优化。
最后，我们在含有选择性抗生素的培养基上进行了选择性培养。
只有含有重组DNA的宿主细胞能够在这种培养条件下生长，形成菌落。
通过筛选，我们成功获得了含有重组DNA的宿主细胞。
结论：通过本次实验，我们成功地进行了DNA重组实验，将目标基因片段插入到宿主细胞的染色体中。
DNA重组技术试验报告
一、实验名称：重组DNA技术二、实验目的：1. 了解掌握DNA重组技术理论基础；2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；3.掌握连接产物的转化方法及操作；4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；三、实验原理：1.重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。
它主要包括以下几个步骤：①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。
cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。
常用于筛选编码蛋白质的结构基因。
基因组DNA 文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA 文库。
②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。
分为克隆载体和表达载体。
克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。
表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。
选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。
④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞（常用大肠杆菌），并使其获得新的表型的过程。
b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。
c、感染：以履菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
DNA重组生物实验报告
DNA重组生物实验报告课程名称：_生命科学导论实验课_ 指导老师：______成绩：__________________实验名称：__基因工程实验__ 实验类型：__生物实验_______同组学生姓名：__一、实验目的和要求基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验中有如下目的和要求：1、通过本实验了解和掌握含GFP基因质粒的提取和琼脂糖DNA电泳的等十个小实验组合而成的基因工程实验的原理和技术。
2、了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的实验思路。
3、培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体会，融汇贯通，寓学于用，感受生物学科的魅力。
二、实验内容和原理基因工程又称DNA重组技术，是将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建成杂种DNA分子（又称重组DNA分子），然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产品等。
基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的建立奠定了扎实的基础。
基因工程技术建立的标志性实验是：①1972年，美国斯坦福大学的伯格(P.Berg)等人将猿猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体DNA分别进行EcoRI酶切，然后用T4DNA连接酶将两个酶切片段进行连接，率先完成了人类历史上第一个DNA分子的体外重组实验，因此荣获了1980年的诺贝尔化学奖。
②1973年，美国斯坦福大学的科恩（S.Cohen）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
上述两大科研成果标志着基因工程技术的诞生。
一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：1.目的基因和载体DNA的获取。
2.目的基因和载体DNA的限制性内切酶的酶切消化。
3.酶切后的目的基因和载体DNA的体外重组连接，以获得重组DNA分子。
重组DNA转化及筛选实验报告
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一，它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一，通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选，构建宿主细胞中的重组DNA，并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料：1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法：1.准备转化液：将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中，混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液，解冻后加入LB培养基中，使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞，放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA，比例为1:10（DNA:转化液）。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液，通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液，用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长，记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12，直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA，进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作，我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时，选择适量的抗生素浓度非常重要，它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后，我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功，而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离，我们获得了纯合阳性克隆菌落。
重组子实验报告
一、实验目的1. 了解DNA重组技术的原理和操作流程。
2. 掌握DNA片段的酶切、连接和转化等基本操作。
3. 学习重组子构建、筛选和鉴定的方法。
二、实验原理DNA重组技术是指利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具，将不同来源的DNA片段按照一定顺序重新组装成新的DNA分子。
通过重组，可以获得具有特定遗传信息的DNA分子，如基因克隆、基因编辑等。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、紫外分光光度计、恒温培养箱、离心机等。
2. 实验试剂：DNA模板、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA载体、感受态细胞、PCR引物、琼脂糖、Tris-HCl缓冲液、DNA标记物等。
四、实验步骤1. 酶切反应a. 将DNA模板与限制性内切酶混合，加入Tris-HCl缓冲液和适当的盐，进行酶切反应。
b. 反应完成后，加入DNA连接酶，进行连接反应。
2. 连接反应a. 将酶切后的DNA片段与DNA载体混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
b. 反应完成后，加入终止剂，终止反应。
3. 转化反应a. 将连接产物与感受态细胞混合，加入CaCl2，进行转化反应。
b. 反应完成后，将转化后的细胞涂布在琼脂糖平板上，进行培养。
4. 重组子筛选a. 在培养过程中，观察平板上的菌落生长情况。
b. 挑选菌落进行PCR扩增，检测是否成功构建重组子。
5. 重组子鉴定a. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带。
b. 将电泳结果与预期结果进行对比，鉴定重组子。
五、实验结果与分析1. 酶切反应：酶切反应后，DNA模板发生断裂，形成一定长度的DNA片段。
2. 连接反应：连接反应后，DNA片段与载体分子连接，形成重组子。
3. 转化反应：转化反应后，重组子被导入感受态细胞。
4. 重组子筛选：通过PCR扩增，成功筛选出重组子。
5. 重组子鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳，鉴定出预期的DNA条带，证明重组子构建成功。
六、实验总结1. 本实验成功构建了重组子，并对其进行了筛选和鉴定。
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一、实验名称：重组DNA技术二、实验目的：1.了解掌握DNA重组技术理论基础；2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；3.掌握连接产物的转化方法及操作；4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；三、实验原理:1.重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。
它主要包括以下几个步骤：①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。
cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。
常用于筛选编码蛋白质的结构基因。
基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。
②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。
分为克隆载体和表达载体。
克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。
表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。
选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。
④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。
b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。
c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
⑤重组体的筛选：可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。
⑥无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞)⑦目的基因的表达2、质粒酶切及鉴定原理限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA序列。
根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。
用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。
本实验采用的限制性内切酶是Bam HI 和Hind III。
对于DNA回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。
目前常用的回收技术有：柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等，其中柱纯化回收法、电洗脱法，经济节省，操作方便，对DNA回收效果好。
本实验采用试剂盒回收（柱纯化回收法），其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶，采用特殊的收集管收集DNA 后，漂洗液洗脱杂质，最后用洗脱液洗出DNA。
四、主要实验仪器：不同规格移液器、EP管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水浴箱、常规台式离心机、恒温孵箱、CP3吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻璃涂布棒等。
五、主要实验试剂：1. 酶切相关试剂：pUC18DNA、λDNA（TIANGEN, MD202）、Hind III（Thermo, ER0501）、Buffer R (10X) （Thermo, BR5）、BamHI（Thermo, ER0051）、BamHI-Lsp1109I Buffer (10X)（Thermo, B57）、pUC18-mir203 质粒DNA （老师提供）。
2.电泳相关试剂：琼脂糖、GoldView、1kb DNA Ladder（TIANGEN，MD111）、DNA电泳loading buffer（6X）（TIANGEN, RT201-01），电泳缓冲液。
3、凝胶DNA回收：小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（庄盟国际生物，ZP202）。
4. 重组体构建相关试剂：T4 DNA连接酶(Thermo, EL0014)、10X T4 DNA 连接buffer( Fermentas, 00044933)。
5. 转化相关试剂：感受态细胞（本实验用感受态细胞DH5α从公司购买）、LB培养基（老师提供）、含Amp琼脂糖平皿（老师提供）、质粒小量提取试剂盒（庄盟国际生物，ZP101）、ddH2O等。
六、实验步骤：1. 载体pUC18和目的DNA酶切（1）质粒DNA酶切反应体系：反应条件：37℃恒温水浴，2hr；室温下放置等待连接。
（2）目的DNA酶切反应体系：反应条件：37℃恒温水浴，2hr；（3）质粒载体双酶切反应体系：反应条件：37℃恒温水浴，2hr；根据以上反应体系配制好后，瞬时离心后置于37℃恒温水浴锅中反应。
2.目的DNA酶切片段电泳鉴定（1）配制1%琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1 %琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5 μL GoldView。
小心混匀并倒在制胶槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子。
将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，准备电泳。
（2）电泳：取20uL酶切后产物，加入4uL DNA电泳loading buffer混匀，上样20uL。
恒压90V电泳40-60min。
（3）紫外灯下观察结果并切胶用于后续试验。
3.目的DNA凝胶条带切割及目的DNA回收根据试剂盒说明书操作（1）将单一的目的DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量，约0.3g。
（2）向胶块中加入3倍体积溶胶液（900 µl），55℃,水浴10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
（4）向吸附柱中加入600 μl 漂洗液W2 （使用前加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
（5）向吸附柱中加入500 μl 漂洗液W2，12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
（6）将吸附柱放入收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心 2 分钟，尽量除去漂洗液。
将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
（7）将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl 的洗脱缓冲液TE，12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，收集DNA 溶液。
4. 连接目的DNA和酶切后的质粒DNA反应体系：配置好以上反应体系，瞬离混匀后，室温，过夜。
5.转化（1）-70℃冰箱取出感受态细胞DH5α，冰浴中融化。
（2）在1.5ml Ep管中加入50μlDH5α感受态细胞和2μl的DNA溶液，温和混匀后置于冰上30min。
（3）将菌液再置于42℃水浴中热激90s后冰浴2min。
（4）然后加入900ul LB液体培养基，置于37℃恒温摇床上复苏3h（160rpm）。
（5）菌液4000r/min离心2敏后。
留下200uL上清液将菌体打散，并均匀涂布在预先准备好的含Amp的LB固体培养皿上，15min后，待菌液被培养基吸收后，倒置放于37℃培养箱中培养过夜。
（6）待细菌生长16h左右时，LB培养基表面长出肉眼可见的菌落，此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆，置于含Amp的LB液体培养基（15mL）离心管，37℃恒温摇床过夜培养（160rpm）。
6. 阳性重组子的克隆待细菌生长16h左右时，LB培养基表面长出肉眼可见的菌落，此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆（以小枪头挑轻触菌落即可），连同枪头一起放入盛约3ml的LB培养基的15ml规格离心管中，37℃恒温摇床过夜培养（160rpm）。
7. 阳性重组子的酶切鉴定（1）质粒提取（根据试剂盒说明书操作）a.收集菌体：取 1.5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心 1 分钟，保留沉淀，尽量吸除上清。
b.重悬菌体：向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl 溶液 1（使用前加入RNaseA），用移液枪吹打彻底悬浮细菌沉淀。
c.裂解菌体：向离心管中加入250 μl 溶液 2，温和地上下翻转 6－8 次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA，造成提取的质粒中混有基因组 DNA 片断。
d.沉淀除杂：向离心管中加入350 μl 溶液 3，立即温和地上下翻转 6–8 次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。
12,000 rpm (~13,400×g )离心 10 分钟，此时在离心管底部形成沉淀。
e.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。
12,000 rpm (~13,400×g) 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：溶液 3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
f.向吸附柱中加入700 μl 漂洗液 W2 （请检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
g.向吸附柱中加入500 μl 漂洗液 W2，12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。