基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建
TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程
TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html实验指南收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。
Tel ：010-********;E-mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。
E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。
⽹络出版时间:2013-3-515:03:12URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.htmlDOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程沈延,黄鹏,张博北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。
TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。
基因敲除斑马鱼构建方法!
基因敲除斑马鱼构建方法!一、基因敲除的设计方案1.1 基因的基本信息确认斑马鱼基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI 等查询。
1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析1.3分析蛋白质的保守结构功能域通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。
1.4 分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。
二、CRISPR活性验证2.1 分析并确认基因组序列设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。
该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。
2.2 合成sgRNA使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。
2.3 显微注射将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。
2.4 活性验证随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。
•如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；•如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）三、突变体制备及确认3.1 F0饲养如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。
3.2 F0可遗传突变的确认将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。
以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。
3.3 F1饲养将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。
3.4 F1确认将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
p53 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 成 功 表 达 ，表 达 的 p53 融 合 蛋 白 分 子 量 大 约 为 53kD，透 析 复 性 后 获 得 了 高 纯 度
可溶性的 p53 蛋白。
关键词：p53 基因；斑马鱼；原核表达
中 图 分 类 号 ：Q786
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2010）03－0526-03
胞。 挑取单克隆菌落接种于 LB 培养基中，37℃摇荡 过夜， 转接扩大培养至菌液 OD600 达 0．5～0．8 时，加 入 终 浓 度 为 1 mmol ／ L 的 IPTG，37℃ 诱 导 1、3、5h 后，分别取样进行 SDS－PAGE 分析，5 h 后收集菌体 溶 于 溶 菌 缓 冲 液 （50 mmol ／ L NaH2PO4，300 mmol ／ L NaCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 值 8．0） 中， 超声破碎菌 体 ，12 000 r ／ min 离 心 20 min， 分 别 取 上 清 和 沉 淀 进行 SDS－PAGE 分析。 1．2．6 p53 蛋 白 的 变 性 纯 化 及 复 性 参 照 Qiagen 镍柱蛋白纯化操作步骤，在变性条件下纯化以包涵 体形式表达的 p53 蛋白。 采用尿素梯度透析法对纯 化的 p53 蛋白进行复性，尿素浓度梯度分别为 8、6、 4、2，0M。 首先将变性纯化的 p53 蛋白用变性结合缓 冲 液 （8 mol ／ L 尿 素 ，100 mmol ／ L NaH2PO4，100mM Tris－HCl， pH 值 8．0）稀释 5 倍后装入透析袋中，放 置在透析液中 （100 mmol ／ L Tris－HCl，100 mmol ／ L NaH2PO4，1 mmol ／ L EDTA，2 mmol ／ L 还原型谷胱甘 肽，0．2 mmol ／ L 氧化型谷胱甘肽，20％丙三醇，1％甘 氨酸，pH 值 8．0），4℃磁力搅拌透析 12 h， 每隔 12 h 更换含低浓度尿素的透析液，其他成分不变，最后 将 p53 透析至水中，离心去除沉淀，复性的 p53 蛋 白 冷 冻 干 燥 后 经 12％ SDS－PAGE 电 泳 检 测 后 于－ 80℃保存。
将制作转基因斑马鱼的实验引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践
Ｋｅ ｙｗｏｒ ｄ ｓ： ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ ； ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｚ ｅ ｂ ｒ ａ ｉｓ ｆ ｈ ； ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ； ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｔ ｅ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ
ＤｏＩ ： １ ０ ． ３ ７ ２ ４ ／ Ｓ Ｐ ． Ｊ ． １ ０ ０ ５ ． ２ ０ １ ３． ０ １ ３ ２ ７
遗传学教学
将 制作转 基 因斑 马鱼 的实验 引入本科 生基 因工程 实验
课教 学 的探索 与实 践
袁 婺洲，邓 云
湖 南 师 范大 学 生 命 科 学 学 院 ，长 沙 ４ １ ０ ０ ８ １
基 因工 程 是生 物技 术 的核心 ，涉 及 基 因片段 的 获取 、基 因克 隆 、基 因转 化 、基 因 的体外 修饰 、转 基 因技术 、基 因表达 及表 达产 物 下游 的大 规模 生产 等 。基 因工程 作 为一 门 实践性 和 技术 性都 很 强 的课
程 ，已经 成 为 国 内外 高校 生物 技术 、生物 工 程及 相
Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅｏ ｆ Ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｈｕ ｎ ａ ｎＮ ｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ４ １ ０ ０ ８ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ａｂｓ ｔ ｒａ ｃ ｔ ： Ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｔ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ ｉ ｓ ｏ ｎ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｒ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ ｃ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｃ ｈ ｉ ｅ ｖ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｎ ｇ ｉ －
转基因斑马鱼构建技术
转基因斑马鱼构建技术
斑马鱼是一种近年来发展非常迅速的模式动物，在生物医学研究领域有越来越多的应用。
斑马鱼和人类的基因同源性85%以上，疾病信号转导通路高度保守，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达99%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，利用高效的ToI2转座酶系统可构建转基因斑马鱼。
斑马鱼作为模式动物，还具有以下的优点：
1、与人类同属于脊椎动物
2、个体较小，因此养殖需要的场地空间较小
3、繁殖力强，可进行高通量筛选
4、体外受精，便于繁育
5、药物用量小
6、早期透明，早期发育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后七天内部器官清晰可见，可以活体进行荧光观察斑马鱼可以用于研究基因表达调控、基因功能域发育、分化、形态发生的关系，也可以用于研究发病机理，也可以用于药物筛选。
[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版
![[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版](https://img.taocdn.com/s3/m/639dd4c214791711cd791766.png)
[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人:王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要:本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光;在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。
关键字:转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂:仪器:试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸;42?恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。
试剂:EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤:转基因斑马鱼构建:1.转染细菌的培养(1)培养基的制备:称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。
分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。
(2)培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。
当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。
(3)含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60?左右，加入Amp(氨苄青霉素)储存液,使终浓度为50 μg/mL,摇匀后铺板。
(4)接种加甘油保存的分别含质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升(5)37 ?摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤:(1). 样本处理:收集已培养12,16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。
过表达Baff转基因斑马鱼的构建
过表达Baff转基因斑马鱼的构建张力;谢英;刘树锋【摘要】Objective To construct pEGFP-Cl-baff, pEGFP-N1 -baff, and pIRES2-EGFP-baff recombinant plasmids, and establish a SLE disease model of Baff overexpressed zebrafish by microinjection and fluorescence screening . The aim is to evaluate the meaning of Baff over expression zebrafish in study of SLE mechanism and drug selection . Methods We cloned baff full length cDNA encoded by 807 bp nuclear acid using spleens RNA of zebrafish by RT-PCR and constructed 3 types of baff overexpression plasmids : pEGFP-Cl -baff, pEGFP-N1-baff- and pIRES2-EGFP-baff. Baff protein expression was estimated by in -vitro cell transfection and Western blotting. Results 3 types of baff overexpression plasmids were examined by agarose gel electrophoresis . Western blotting and in-vitro transfection confirmed the expression of Baff-GFP fusion protein. We also obtained the baff over expression zebrafish by microinjection and fluorescence screening. Conclusion All the plasmid we constructed in our research have been estimated and could be used to generate the disease model of baff overexpression zebrafish which can be manipulated for immune -disease research.%目的体外克隆斑马鱼baff基因并分别构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒,通过胚胎显微注射获得过表达baff的转基因斑马鱼,以探讨其作为人类SLE模型和用于SLE药物筛选的意义.方法通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆出斑马鱼baff基因全长807 bp蛋白编码区域,分别构建baff过表达载体pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff 及 pIRES2-EGFP-baff重组质粒,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达后,通过胚胎显微注射过表达载体,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼.结果通过体外细胞转染实验与免疫印迹法验证了pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff转染后细胞Baff-GFP融合蛋白的成功表达,通过胚胎显微注射与GFP荧光筛选,成功获得过表达baff的转基因斑马鱼.结论本研究所构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒均可通过显微注射获得过表达baff的阳性转基因斑马鱼,为进一步探讨其作为人类SLE疾病模型的意义及Baff拮抗药物的筛选奠定基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】5页(P46-49,后插4)【关键词】系统性红斑狼疮;B细胞活化因子;斑马鱼;转基因【作者】张力;谢英;刘树锋【作者单位】河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R332斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点，使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一［1，2］。