斑马鱼胚胎整体原位免疫荧光实验
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
敲低胎盘特异性蛋白8(PLAC8)抑制人胚胎干细胞增殖并促进其凋亡
细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2020, 36(12)1089•论著• 文章编号：1007 - 8738(2020)12 -1089 -06敲低胎盘特异性蛋白8(PLAC8)抑制人胚胎干细胞增殖并促进其凋亡李如梅"2,李敏2,陈蕾Z **收稿日期：2020 - 03 - 06；接受日期：2020 -11 -03基金项目：国家自然科学基金(8170060984)；海军“十二五”项目(CHJ11J015)作者简介：李如梅(1994 -),女，安徽蚌埠人，医师，硕士研究生Tel ： 188****1524； E-mail ： 1596876521 @qq. com* 通讯作者，陈蕾，E-mail : 3313400243@ qq. com('安徽医科大学海军临床学院妇产科，安徽合肥230032；'解放军总医院第六医学中心妇产科，北京100048)［摘要］目的 探讨胎盘特异性蛋白8(PLAC8)对人胚胎干细胞(hESC)增殖和凋亡的影响。
方法 实时荧光定量PCR 和Western blot 法检测空载体组、PLAC8短发夹RNA(shPLAC8)组、过表达PLAC8(PLAC8-OE)组感染hESC 的效率；以及各组细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白Dl(CCNDl)的mRNA 和蛋白水平。
流式细胞术检测敲低和过表达PLAC8对hESC 凋亡的影响。
结果PLAC8敲低组的CCND1、PCNA 的mRNA 和蛋白水平降低，细胞凋亡增加；PLAC8过表达组CCND1和PCNA 的mRNA 和蛋白表达略上调，细胞凋亡略有下降，但差异均无统计学意义。
结论 敲低PLAC8的表达会抑制hESC 增殖并促进其凋亡。
［关键词］人胚胎干细胞(hESC)；胎盘特异性蛋白8(PLAC8)；细胞增殖；细胞凋亡［中图分类号］R392-33, Q813.7, Q25［文献标志码］A体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET )是现代最常用的辅助生殖技术 (assisted reproductive technology , ART),其诞生至今经历了飞速的发展，为广大不孕不育患者带来了福 音⑴。
斑马鱼原位杂交实验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。
自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。
Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。
ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。
同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。
2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。
第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。
固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。
实验步骤：1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。
固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。
可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。
使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。
2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。
丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。
4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。
6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。
7. 用封闭液清洗胚胎2次。
8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。
加入合适浓度的一抗。
一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。
9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。
根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。
10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。
11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。
12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。
13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。
14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是现代生物技术的重要组成部分，通过改变生物体的基因组，使其具有新的特性或功能。
斑马鱼作为一种常见的实验动物模型，被广泛应用于生物学研究中。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖技巧，帮助研究者顺利进行相关实验。
一、斑马鱼胚胎的获取斑马鱼胚胎的获取是进行转基因实验的第一步。
通常情况下，斑马鱼胚胎可以通过自然产卵或人工授精获得。
为了提高产卵的效率，可以将斑马鱼置于特定的环境条件下，如适宜的水温和光照条件。
此外，还可以使用药物刺激促进斑马鱼产卵。
对于人工授精，可以将雄性和雌性斑马鱼分别放入相同的容器中，利用它们的自然产卵和受精过程来获得胚胎。
二、胚胎的培养获得斑马鱼胚胎后，需要进行胚胎的培养。
首先，将胚胎转移到培养皿中，添加适宜的培养液，如E3培养液。
E3培养液中含有必需的营养物质，可以为斑马鱼胚胎提供所需的营养。
同时，保持培养皿中的水温和光照条件也非常重要，通常将其保持在28-30摄氏度，并提供适量的光照。
三、转基因技术的应用在斑马鱼胚胎培养的基础上，可以进行转基因技术的应用。
目前，常用的转基因技术包括转基因敲除和转基因过表达。
转基因敲除是通过将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其失去特定基因的功能。
而转基因过表达是将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其在特定生理条件下过度表达。
这些转基因技术可以帮助研究者研究特定基因的功能和调控机制。
四、转基因斑马鱼胚胎的鉴定进行转基因实验后，需要对转基因斑马鱼胚胎进行鉴定。
常用的鉴定方法包括PCR、荧光显微镜观察和基因测序等。
PCR是一种常用的分子生物学技术，可以通过检测特定基因的存在来鉴定转基因斑马鱼胚胎。
荧光显微镜观察则是通过检测转基因斑马鱼是否发出特定颜色的荧光来鉴定。
基因测序则可以直接确定转基因斑马鱼胚胎中特定基因的序列，从而进行准确的鉴定。
五、转基因斑马鱼胚胎的进一步研究鉴定转基因斑马鱼胚胎后，可以进行进一步的研究。
例如，可以观察转基因斑马鱼胚胎在不同生理条件下的表型变化。
斑马鱼的原位杂交技术
斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。
)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。
5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。
FISH以及免疫荧光的实验步骤
FISH以及免疫荧光的实验步骤FISH（荧光原位杂交）是一种用于检测DNA或RNA序列的实验技术。
该技术结合了传统原位杂交和荧光显微镜技术，可以在细胞或组织样本中定位、标记和可视化特定的DNA或RNA分子。
下面是一个典型的FISH实验的步骤：1.准备标记探针：选择适当的探针来标记目标DNA或RNA序列。
探针通常是短的DNA或RNA片段，与目标序列互补，可以与其发生特异性杂交。
这些探针可以使用不同的标记物进行标记，如荧光染料或辐射性同位素。
2.样品制备：根据需要，制备细胞悬液或组织切片样品。
细胞悬液可以通过离心细胞，将细胞固定在载玻片上。
组织切片可以使用刮片或切片机获得，然后固定在载玻片上。
3.固定样品：将细胞悬液或组织切片固定在载玻片上，以保持细胞或组织的形态结构。
常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。
4. 渗透化处理：使用渗透化剂渗透细胞或组织样品，以增加探针和标记物的进入性能。
常用的渗透化剂包括蛋白酶K和Triton X-100。
5.探针杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA序列结合。
首先在浓度适宜的探针液中孵育样品，使探针与目标序列发生杂交。
温度和时间取决于探针和目标序列的碱基组成和长度，通常需要在高温下进行，以增加探针与目标序列的特异性。
6.杂交后的冲洗：使用适当的缓冲液冲洗样品，以去除未结合的探针和杂交条件中的非特异性结合。
冲洗通常需要进行多次，以确保特异性结合。
7.荧光染色：如果探针是荧光标记的，在杂交后可以直接进行荧光染色。
将样品浸泡在适当浓度的荧光染料中，以标记目标序列。
染色时间通常较短，一般在15-30分钟左右。
8.荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察和记录标记的目标序列的位置和数量。
使用适当的滤光片来选择和分离目标染色的荧光波长。
利用计算机软件，可以对显微镜下的图像进行分析和处理，以获得更多的信息。
在进行FISH实验时，需要注意一些技术细节和注意事项：1.适当的正向和阴性对照是必要的，以确保实验的准确性和可靠性。
分子生物学实验技术斑马鱼胚胎显微注射实验步骤
斑马鱼胚胎显微注射实验步骤：显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。
可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。
是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。
显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。
这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。
运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。
斑马鱼个体小，养殖成本低，能大规模繁殖，胚胎透明，体外发育，肉眼可见，因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。
1、主要试剂的配制（1）胚胎培养液的配制称取0.8g NaCl、0.04g KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4•7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L。
（2）显微注射指示剂的配制称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中，配制成2％的母液。
先用1mm滤膜过滤后，再用0.22mm的滤膜再次过滤，然后储存在-20℃冰箱里备用。
2、显微注射操作（1）注射针头的拉制：装上一根直径为1mm的毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。
设定参数为：Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。
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斑马鱼胚胎整体原位免疫荧光实验第一天：
固定：收集斑马鱼胚胎于解剖显微镜下去除绒毛膜，加入4％多聚甲醛（溶于无RNA酶的PBS），4℃固定8h。
然后加入更换新鲜纯甲醇后于－20℃长期保存。
第二天：
洗涤和通透：在室温下，以25％PBST/75％甲醇、50％PBST/50％甲醇、75％PBST/25％甲醇逐级复水，每步3 min，100％PBST洗涤三次，各5 min。
用H2O洗涤1次，5 min
用丙酮通透胚胎1次，7 min（-200C）
用H2O洗涤1次，5 min
用PBST洗涤1次， 5 min
封闭：加入适量封闭液，于室温下放置1.5 h以上。
抗体孵育：更换新鲜封闭液，加入一抗（10μg/ml），置于4℃过夜。
第三天：
清洗：用洗涤液（1% BSA，1% DMSO的PBST溶液）清洗抗体8次，前7次每次15min，第8次2h。
封闭：加入适量封闭液，于室温下放置1.5 h。
抗体孵育：更换新鲜封闭液，加入二抗，置于4℃过夜。
第四天：
清洗：用洗涤液（1% BSA，1% DMSO的PBST溶液）清洗抗体8次，每次15min。
用PBST溶液洗涤胚胎2次，每次5min。