goosecoid在斑马鱼早期发育中的作用.doc
敲除SOCS1a引起斑马鱼肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗
分类号学号 D********* 学校代码10487密级博士学位论文敲除SOCS1a 引起斑马鱼肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗学位申请人： 戴梓茹学科专业：生物化学与分子生物学指导教师：刘木根教授 殷战研究员答辩日期：2015年05月10日Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Biochemistry and Molecular BiologyDepletion of Suppressor of Cytokine Signaling-1a Causes Hepatic Steatosis and Insulin Resistance inZebrafishPh.D.Candidate: Ziru DaiMajor: Biochemistry and Molecular BiologySupervisor: Prof. Mugen Liu Prof. Zhan YinHuazhongUniversity of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China,May, 2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。
对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
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斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达
斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达作者：陈华林晨韬陈曦葛均青来源：《南方农业学报》2022年第01期摘要：【目的】實现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达，以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白，为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。
【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析，经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因，亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以IPTG进行诱导表达，并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。
【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。
Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp，共编码196个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp，共编码191个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。
Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽，而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构，但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。
在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中，Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近，而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。
将合成的斑马鱼 g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞，20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h，可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2，纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL，对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。
甲基睾酮对斑马鱼成鱼的影响
甲基睾酮对斑马鱼成鱼的影响刘晓红2010444033 摘要：用含雄性激素甲基睾酮(MT)的饲料饲喂斑马鱼(Danio rerio)来探讨外源激素对其性腺发育的影响。
本文一斑马鱼为研究对象，探讨了甲基睾酮对斑马鱼性腺发育的影响。
试验中将斑马鱼随机分为4组：空白对照组，95%乙醇溶剂对照组，两个30μg/l甲基睾酮实验组。
每组30尾斑马鱼，放置在室内饲喂7天，每天记录斑马鱼的生长情况，7天后取其性腺等器官，采用石蜡切片技术，在显微镜下观察其性腺发育及生物学变化。
结果表明甲基睾酮对斑马鱼性腺的发育受到抑制,卵巢结构变化明显。
但是对其成活率等无明显影响。
关键词：斑马鱼甲基睾酮卵巢生长发育斑马鱼(Brachydanio rerio)属鲤科，短担尼鱼属，俗称蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，是一种典型的亚热带观赏鱼类。
具有产卵量大、繁殖周期快、突变表现型明显、胚体透明、胚胎发育同步且发育速度快等特点，被喻为理想的分子生物学和免疫学研究的脊椎动物模型，具有很高的科研价值和广泛的应用前景，是四大模式生物之一。
目前国内外对斑马鱼的研究涉及到胚胎学、内分泌学、生物学、毒理学、遗传学、分子生物学等多个方面 J，但对于斑马鱼卵巢发育的研究在国内还未有报道。
本文对斑马鱼卵巢发育进行了研究，以期能丰富斑马鱼发育生物学、繁殖生物学内容，也为其它小型热带观赏鱼的养殖与繁殖提供一些理论参考[1]。
本次实验采用用含有30μg/g甲基睾酮饲料饲喂斑马鱼来探究甲基睾酮对雌性斑马鱼性腺的影响，旨在对其性别控制的生物学基础及性逆转机制进行理论上的探讨，为斑马鱼养殖生产提供科学依据[2]。
1材料与方法：1.1实验试剂仪器和30μg/g甲基睾酮的饲料，生物显微镜，切片机，电热恒温干燥箱，电子天平，甲基睾酮，布温氏固定液，石蜡，代氏苏木精染液，0.5%伊红染液，二甲苯，不同浓度梯度的乙醇，0.1%盐酸，0.1%NaOH。
1.2实验材料实验动物：同步受精的斑马鱼1.3试验方法1.3.1斑马鱼的饲喂实验设置3个处理组（阴性对照组，空白对照组，实验组），其中设置两个实验组。
谷甾醇对斑马鱼生长发育和生殖的影响
谷甾醇对斑马鱼生长发育和生殖的影响作者：冯子懿侯丽萍郑果梁艺聪何骏驹来源：《湖南农业科学》2017年第02期摘要：为了研究谷甾醇（sitosterol）暴露对斑马鱼（Barchydanio rerio var）内分泌的干扰效应，通过不同浓度的谷甾醇（50、100、150、200μg/L）对雌性斑马鱼进行为期60 d的水浴暴露，同时设乙醇对照，分别于60 d后测定各组分雌性斑马鱼的生长指标，对部分组织进行切片观察，从组织病理学和毒理学方面评估谷甾醇暴露的毒性效应。
结果表明：在200μg/L谷甾醇暴露下，斑马鱼全部死亡，其他各浓度处理与对照组相比，除臀鳍数随谷甾醇浓度的增加呈现倒“U”型趋势，以及肝重随谷甾醇浓度的增加而上升外，其他各生长指标均不同程度受到抑制，抑制作用与暴露浓度呈明显的剂量效应。
此外，性腺指数（GSI）呈下降趋势，肝体指数（HSI）呈上升趋势，各组织切片也表现出明显的毒性反应。
因此，可初步判断谷甾醇对斑马鱼的生长发育和繁殖系统会产生较大影响。
关键词：谷甾醇；斑马鱼；暴露；生长繁殖中图分类号：S949 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2017）02-0074-06内分泌干扰物（Endocrinemsruptors chemicals，EDCs）是指能够干扰体内天然激素合成、分泌、传输、键合或清除的激素类似物，在环境中含量很低。
谷甾醇（sitosterol）是植物雌激素（Phytoestrogen，PE）类中一种最常见的内分泌干扰物，由于在牛皮纸或纸浆中的漂白污水中广泛检出而受到人们的关注。
研究表明，多种鱼类的发育异常与污水中的环境雌激素有关。
环境中的雌激素通过生物富集作用，造成鱼类生长发育迟缓、生殖器和性腺形态功能异常等。
其中，β-谷甾醇对血液中卵黄蛋白原水平、性别分化以及肝细胞病变程度均具有明显干扰效应，可使成熟精母细胞和精子的比例失衡。
斑马鱼（Barchydanio rerio vat）是辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤形目（Cypfiniformes）鲤形科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼。
寡义反核苷酸的设计及使用
Morpholino的设计及使用发育生物学家们（他们所使用的模型动物在遗传学方面的研究往往还不完善，当然有的动物已经研究得很完善了）所面临的很重要的问题之一是如何在生物体发育时期抑制他们所感兴趣的基因的活动——这样一来生物学家们就可以研究这个基因的正常的生物学功能了。
一项被广泛接受的方法是反义技术——尤其是反义寡核苷酸（morpholino，简称MO）技术。
在本文中，我们将简述该药物（指MO）的使用，并举例说明它们如何应用于发育机制的研究。
我们还将讨论怎样应用MO就会导致产生错误的结果——包括没能将目的基因靶向敲除，同时我们建议研究人员使用对照实验，这样就能对MO实验作出正确的解释。
简介为了理解发育早期的分子机制，发育生物学家们长期以来一直希望能有这样一种技术，即：可以在特定的发育时期、在特定的细胞中阻断特定的基因的表达。
这一目标目前还没有实现，尽管研究人员在小鼠胚胎上已经很接近这一最终目标了——他们使用的方法是靶向突变和Cre重组酶。
即便如此，仍有很多困难没有克服：试图干扰某一个基因的功能往往会对另一个基因产生不希望发生的“副作用”，而使用Cre重组酶则需要警惕Cre基因表达时所具有的潜在的毒性作用。
其它物种又如何呢？毫无疑问，对其它脊椎动物和无脊椎动物的研究已经深入到了研究在发育早期的基本机制的地步，而且与使用哺乳动物胚胎为研究对象相比，使用这些动物具有很多明显的优势——包括可接受性、成本、时间，此外这些动物本身就很令人感兴趣。
在所有这些动物中，目前都还没有建立常规的基因打靶技术。
尽管传统的遗传筛查技术在理解某一特定的过程方面具有不可估量的价值，但它既不能保证具体到特定的目的基因，也不能保证使生物体产生一种无效突变。
总之，研究人员需要一种能阻断基因功能的方法。
显性抑制方法有一定的应用价值，但不是最佳的选择。
最佳的选择是具备较高特异性的反义RNA 技术。
反义RNA技术不但可以用于脊椎动物，还可以应用于组织细胞中，而且它们在寻找新药方面正在发挥越来越大的作用。
斑马鱼作为研究营养与生长的模式生物：向水产鱼类的营养基因组学的研究提供参考
斑马鱼作为研究营养与发育的模式生物：为水产鱼类的营养基因组学的研究提供参考摘要斑马鱼是最普遍的用来研究毒理学、发育生物学、神经生物学和分子遗传学的模式生物。
人们提出把它当做一个可能的研究鱼类营养与发育的模型。
斑马鱼用于这一领域研究的好处是它们尺寸小、生殖周期短（12-14周）可以产出大量的卵。
后来有了大量的分子工具，同时可以通过基因分析获得相关信息，但是斑马鱼仍然在鱼类的营养基因组学的研究中当做模式生物使用。
作为模式生物，对其每一个特点的研究都是细微的，这是因为这些特点是用来推理几个生物过程是如何在相关生物身上发生的，同时为扩增我们在鱼类营养和发育机制方面的知识做出重大的贡献。
这篇综述的目的是展示斑马鱼在营养和发育方面的相关研究，从而说明斑马鱼作为研究鱼类营养基因组学的模式生物的价值。
我们特别强调斑马鱼中由营养因素导致的基因表达和遗传变异可以用来阐明水产养殖鱼类中的类似过程。
关键字：斑马鱼，发育，营养，营养基因组学，比较基因组学前言斑马鱼已经成为研究在个体发育、神经生物学分子遗传学研究的十分普遍的模式生物(Driever et al. 1994; Roush 1996; Bergeronet al. 2008)。
近来，人们提出在鱼类营养和发育的研究方面斑马鱼可以作为一种模式生物(Alestro m etal.2006; Dahm andGeisler 2006; De-Santis and Jerry 2007; Wright et al.2006; Johnston et al. 2008)。
人们一个主要的研究兴趣就是生长发育的特点。
因为这与水产养殖行业中，鱼类的生产量和可获取的利益密切相关(De-Santis and Jerry 2007)。
这些特点中，表型性状是基因控制的，但也取决于环境因素，这些因素中，又直接由营养条件影响(Moriyama et al.2000)。
基因研究工具的发展，使我们有机会去弄清楚数量性状相关的基因的变化，随着那些影响养殖生物生长特征的QTL基因座图谱的建立，在生长发育中鉴别候选基因变得非常有效的(Davis and Hetzel2000; Fjalestad et al. 2003; Reid et al. 2005; Aranedaet al. 2008; Lo Pestri et al. 2009; Dumas et al. 2010)。
甲基睾酮对斑马鱼成鱼的影响
3.4实验结论
通过此次实验，可以得出结论：甲基睾酮对斑马鱼的生长发育会产生一定的影响，而且导致斑马鱼的性发育受到影响，在一定程度上会影响成活率。对于斑马鱼性腺的影响具体为：甲基睾酮外源激素的使用，使卵巢发育受到一定程度的抑制，以至于使卵巢的结构变化明显，促进精巢的发育。
1.2实验方法：
1.2.1甲基睾酮饲料的配制
乙醇喷雾法：按照30μg/g剂量称取甲基睾酮溶于95%乙醇中，充分溶解后喷洒在饵料中，放入40℃烘箱中烤干。
1.2.2组别设计与处理方法
本实验设置四个组：实验一组，实验二组，空白对照组、阴性对照组。每组有30尾斑马鱼。
实验组用配置好的30μg/g甲基睾酮饲料饲喂，空白对照组用普通饲料饲喂，阴性对照组用95%乙醇饲喂，并且要定时适量的饲喂，看情况及时换水，处理一周，各组员按上午、下午各一次，观察鱼的活性，记录存活率，随机捞取10条斑马鱼称重，测量4条鱼的体长，均求取平均值记录一条鱼的体重和体长变化。
1材料与方法
1.1仪器和试剂：
1.1.1实验用鱼——斑马鱼
斑马鱼是一种小型热带观赏鱼。由于其具有个体小、产卵量大、繁殖周期快、体外受精、胚胎透明、突变表现性明显、易于观察、胚胎发育同步且发育速度快、饲养简便等优点，除了具有经济、观赏价值外，还以其自身独有的优势被广泛的应用与发育生物学、遗传学等领域的研究，有很高的科研价值和广泛的应用前景，也因此成为研究最广泛的脊椎动物模式生物之一。
3.2实验组结果
实验组一组和二组都用30μg/g甲基睾酮进行饲喂，结果见表三、表四，附图五、附图六。
器官发育过程中斑马鱼secl3基因之功能研究.doc
器官发育过程中斑马鱼secl3基因之功能研究第一章前言科学的发展大致可以分为三个时期：1) 16世纪以前的古代科学时期；2) 16-19世纪的近代科学时期；3)20世纪以来的现代科学时期。
16世纪以前的科学大都是描述性，经验性以及猜测性的，例如亚里士多德的《动物志》以及中国的阴阳五行说。
16-19世纪是以物理学和化学为主导的科学快速发展的阶段，这一时期产生了许多物理学和化学的重大发现，例如能量转化与守恒定律，麦克斯韦电磁理论，原子论以及元素周期表的确立。
生命科学的喊起也是从这个时期开始的，主要的发现有细胞理论的建立、遗传定律的发现和进化论的提出。
20世纪以来的科学强调系统性，目的性。
其结论的获得大都建立在全面而又缜密的实验基础上。
这一时期的科学重点逐渐从物理学和化学转向了生命科学。
生命的起源乃至多细胞生物的形成一直以来都是一个谜，不过随着生命科学的快速发展这个谜正被一步一步的揭开。
现在知道多细胞生物是从一个受精卵发育而来的。
但是，关于这个受精卵如何受精，如何发育，有多少基因和信号通路参与这一过程等问题都还没有得到完满的解答。
因此，寻求代表性的生物并以此为载体开展个体发育的研究便成为亟待解决的问题。
正是在这一需求和背景下，许多代表性的生物，即模式生物应运而生。
例如秀丽隐杆线虫，果绳，斑马鱼，爪蟾，鸡胚，小鼠以及植物学研究中常用到的拟南界，水稻和大麦。
模式生物由于其进化上的保守性以及实验上的可操作性，巳经逐渐成为科研人员用以回答生命问题和解释生命现象的重要工具。
斑马鱼Daniorerio)原产于印度，盂加拉国，是一种热带淡水鱼类。
不同于其他脊推模式生物，例如爪蟾，鸡胚以及小鼠，斑马鱼有其突出的优点：1)世代时间短；2)雌雄成鱼每周都可以交配产卵；3)每对雌雄成鱼交配产卵多，大概100?300粒；4)胚胎体外受精，体外发育；5)整个胚胎早期发育透明可见；6)许多生物化学，遗传学，发育生物学以及分子生物学的实验方法在斑马鱼身上极其容易实现；7)斑马鱼基因组测序也已基本完成。
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goosecoid在斑马鱼早期发育中的作用
Wnt/β catenin信号通路在早期胚胎发育中起到非常重要作用,它调控胚胎背腹图式发生。
goosecoid(gsc)基因是经典Wnt信号通路的下游靶基因之一,同时对Wnt信号起负反馈抑制作用。
之前报道中,gsc在小鼠和人中突变之后都会产生骨骼发育不全等症状,而目前关于gsc在斑马鱼中的具体生理功能还不是很清楚。
之前研究表明,用吗啡基-吗啉基技术(Morpholino,MO)敲低斑马鱼gsc,无明显缺陷。
MO由于其作用时间短的限制,不能很好的研究基因在后期发育中的功能。
而近年来的出现的基因编辑技术如TALENs,有着靶向高,操作方便的优点,成为可以用于基因功能的研究的新工具。
为了研究gsc在斑马鱼中的具体功能,我们利用TALENs技术,构建了斑马鱼gsc突变体模型,用于研究gsc在斑马鱼中的早期发育中的作用。
得到的结果如下:(1)利用TLANEs技术敲除斑马鱼gsc,筛选得到移码缺失7bp的突变体。
(2)gsc杂合突变体自交结果显示,突变体早期无明显背腹缺陷,但发育至受精后第五天(5 dpf)时,鱼鳔发育缺陷。
测序表明鱼鳔缺失个体为纯合突变体,经统计其占全部胚胎的21%。
表明gsc 突变与鱼鳔缺陷是相关的。
(3)对gsc突变体进行石蜡切片及苏木精伊红(HE)染色,结果显示,突变体鱼鳔结构存在。
(4)gsc突变体中,鱼鳔标记基因hb9原位杂交结果显示,鱼鳔发生未受到影响。
表明突变体鱼鳔结构正常,但未充气。
(5)充气由口、咽、鳔管等多个器官协调完成,而gsc后期特异表达在咽部。
gsc突变体咽部软骨阿尔新蓝染色,及石蜡切片,苏木精伊红染色,结果均表
明突变体咽部结构正常。
表明gsc突变后,鱼鳔未充气不是咽部异常导致的。
(6)鱼鳔充气还受到神经调控,gsc后期表达在头部端脑和间脑,因此可能与鱼鳔充气有联系。
利用LiCl处理野生型胚胎,发育至第五天时,头部端脑和间脑缺失,鱼鳔不充气。
结果表明,头部神经缺失会导致鱼鳔不充气。
进一步工作需要证明gsc突变体头部神经是否异常,这样就能建立gsc突变后,头部神经缺失从而导致鱼鳔不充气的联系。