基因工程实验报告
基因合成技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因合成的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉基因合成仪器的使用方法。
3. 了解基因合成的应用领域。
二、实验原理基因合成是指利用化学方法，按照特定的DNA序列，合成出具有生物学活性的DNA 片段。
该技术是现代生物技术领域的重要手段之一，广泛应用于基因克隆、基因编辑、基因治疗等领域。
基因合成的原理基于DNA双螺旋结构和碱基互补配对原则。
在实验过程中，首先根据设计好的基因序列，合成相应的寡核苷酸引物；然后，通过PCR技术扩增目的基因；最后，将扩增的目的基因克隆到载体上，进行后续的实验操作。
三、实验材料1. 基因合成仪2. PCR仪3. DNA序列分析软件4. DNA合成试剂5. PCR试剂6. 载体DNA7. 质粒提取试剂盒8. 琼脂糖凝胶电泳试剂盒9. DNA连接酶10. DNA标记物四、实验步骤1. 设计基因序列：根据实验目的，设计目的基因的DNA序列，并利用DNA序列分析软件进行优化。
2. 合成寡核苷酸引物：根据设计好的基因序列，合成相应的寡核苷酸引物。
3. PCR扩增目的基因：将合成的寡核苷酸引物、模板DNA、PCR试剂等混合，进行PCR扩增。
4. 琼脂糖凝胶电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的基因的扩增情况。
5. 质粒提取：将PCR产物克隆到载体上，进行质粒提取。
6. DNA连接：将质粒与目的基因进行连接。
7. 转化：将连接后的质粒转化到宿主细胞中。
8. 筛选阳性克隆：通过PCR、测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
9. 阳性克隆的验证：对阳性克隆进行DNA测序，验证目的基因的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过琼脂糖凝胶电泳检测，观察到目的基因的扩增条带，表明目的基因已成功克隆。
2. 阳性克隆的筛选：通过PCR和测序，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
3. 阳性克隆的验证：DNA测序结果表明，目的基因序列与设计序列一致，验证了目的基因的正确性。
基因工程 实验报告
基因工程实验报告学号姓名1实验目的（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。
（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。
（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。
（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。
（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。
2 实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。
碱裂法获得的质粒DNA 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。
2.2 PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。
在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。
在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。
反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA 序列以指数形式扩增。
循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。
基因工程实验报告
基因工程实验报告一、实验目的：本实验旨在掌握基因工程的基本操作技能，了解DNA的提取、PCR扩增和基因克隆等基本实验过程，并通过实际操作检测转基因植物的存在。
二、实验原理：1.DNA提取：采用传统的CTAB法提取植物基因组DNA，目的是获得待测植物样品中的基因组DNA。
2.PCR扩增：选用合适的引物，利用PCR技术将待测基因扩增出来。
PCR反应中需要设置阳性对照、阴性对照和试验样品，以确定PCR扩增结果的可靠性。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因与质粒载体进行连接，再将重组质粒导入大肠杆菌进行转化培养，最后通过酶切和测序等方法验证目标基因的克隆成功与否。
三、实验步骤：1.DNA提取：将待测植物样品加入CTAB提取缓冲液中，酶解并脱脂植物细胞，通过乙酰酚/氯仿法提取总DNA。
2. PCR扩增：设计合适的引物，进行PCR反应。
反应条件通常为94℃预变性5min，然后循环20-35次，每次循环包括94℃变性30s、56-68℃退火30s、72℃延伸1-2min，最后72℃延伸10min。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因进行酶切，并与质粒载体进行连接，然后转化大肠杆菌进行培养。
通过PCR重放大和酶切验证目标基因是否成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序等方法对目标基因进行验证，判断基因克隆是否成功。
四、实验结果与分析：1.DNA提取：从待测植物样品中成功提取到总DNA，并进行酶切分析，可见DNA带状条带。
2.PCR扩增：通过PCR扩增，得到了目标基因的特异性条带，并且也验证了阳性对照和阴性对照的准确性。
3.基因克隆：通过酶切和重放大等方法验证了目标基因的成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序结果，确认目标基因与已知序列一致，说明基因克隆成功。
五、实验结论：通过本实验，我们掌握了基因工程的基本操作技能，成功进行了DNA提取、PCR扩增和基因克隆等实验过程，并通过测序等方法验证了目标基因的克隆成功。
基因工程实验报告
基因工程实验报告摘要：提取小麦的总的RNA通过RT—PCR扩增出GAPDH截短体基因ｃDNA，ＰＣＲ扩增ｃDNA获得大量目的基因，对目的基因和表达载体p ＧＥＸ４Ｔ－１进行双酶切，通过电泳分离条带胶回收酶切的目的基因和载体，然后载体和目的基因连接构建表达载体，重组载体转入大肠杆菌top10中大量复制目的基因；提取质粒，转入大肠杆菌bl21，通过ＩＰＴＧ诱导目的基因的表达；通过ＳＤＳ染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交检验目的蛋白是否表达。
实验流程：小麦幼苗总ＲＮＡ提取ＲＴ＿ＰＣＲ扩增目的基因表达载体构建表达菌株转化（ｔｏｐ１０）从ｔｏｐ１０转入ＢＬ２１诱导表达Ｗｅｓｅｒｎ杂交一．目的基因的获得１．小麦总ｒｎａ的提取（Ｔｒｉｚｏｌ法）１在研钵中加入液氮，再将小麦剪成小片段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的钥匙取１００ｕｌ粉末于已加入１ｍｌ的ｔｒｉｚｏｌ的ＥＰ管中，充分混匀。
２室温放置５ｍｉｎ，然后加入２ｏｏｕｌ的氯仿，剧烈震荡。
３１２０００ｒｐｍ离心１０分钟，取上清于新的ＥＰ管，加入500ul异丙醇，温和颠倒，室温放置10分钟，12000rpm离心10分钟。
4小心弃上清，加入75%乙醇，混匀，4度12000rpm离心5分钟。
5重复46弃上清，室温干燥5-10分钟，用30uldepc溶解rna。
2.rna电泳检测是否提取出rna（10ulrna+1ul buffer）图中出现明显的亮的条带的即表示提取出rna，其中我们提取的rna比较少条带不明显，可能是操作过程中被污染，所以在提取rna是一定要注意防止rna降解，因为空气中随处都是rna酶，所以要带上手套，快速操作，尽量不要暴露在空气中，使用处理过的试管，器材。
3.RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 rna反转录Total RNA 6ulOligo dt primer 1ulH2o 5ul65℃5min,补加下列试剂5×reaction buffer 4ulRibolock rnase inhibitor 1ul10mM dntp mix 2ulRevertaid m-mulv reverse transcripase 1ul42℃ 60min70℃ 5min3.2 PCR扩增目的基因（表达引物扩增 25ul)2×pcr mix 12.5ul 95℃1mincDNA 1ul 95℃10s引物GAPDH1-1 1ul 58℃ 20s 35cycle引物GAPDH1-2 1ul 72℃45sH2O 9.5ul 72℃10min通过图片的条带可以看出pcr扩增的产物；通过RT-PCR获得的目的片段，为连续表达的基因片段，去除了真核基因中的内含子序列，通过重组质粒载体的构建可以直接在宿主大肠杆菌中克隆和表达。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程实验报告
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
基因工程实验报告
基因工程实验报告生命学院生技114班摘要：一、本次试验内容概况如下：（1）准备植物材料：小麦幼苗（2）对基因进行双酶切，准备的载体进行双酶切，转移Top10菌株。
（3）进行PCR检测，查看检测结果是否成功，成功则证明转入了BL21菌株，进行表达过程。
（4）进行电泳。
（目的蛋白的大小会知道，高诱导。
证明符合预期结果。
说明此区域该目的基因大量表达，其他区域目的基因没有大量表达。
）（5）用Weatern杂交去证明。
因为载体是已知的，在相应位置杂交出杂带，证明的该目的基因确实克隆到了载体上，并且蛋白质进一步进行了表达。
二、实验流程：用Trizol 法提取小麦总RNA→用RT-PCR技术扩增GAPDH截短体基因→用琼脂糖凝胶电泳进行片段胶回收→表达载体pGEX4T—1的构建→表达菌株转化→诱导表达→Western杂交关键词：RNA提取、RT-PCR扩增目的基因cDNA、琼脂糖电泳、质粒提取、表达载体的目的片段的酶切、载体和外源DNA的连接、感受态细胞的制备及转化、重组质粒的筛选、鉴定及转化、目的基因诱导表达、Western Blotting检测、DNA的传化与回收、培养基制备和细菌培养具体实验过程：一、<一>小麦总RNA提取1、材料设备：小麦幼苗、高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研体、剪刀、镊子。
2、试剂：（1）0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）（2）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
（3）无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%的DEPC（体积/体积），处理过后高压灭菌。
（4）Trizol（5）75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
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基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。
通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。
关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。
为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
（一）实验过程1.实验部分流程：2．小麦总RNA提取（Trizol法）2.1 材料小麦幼苗2.2 试剂配制及器具处理① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
④Trizol⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
⑥氯仿(最好用新的)。
⑦异丙醇(最好用新的)。
2.3 操作步骤：①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。
②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。
室温放置10min，12000rpm 离心10min。
④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。
⑤重复步骤④。
⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。
用30µL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
3. RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 试剂① RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤ M-MULV反转录酶⑥ RNA抑制剂（RNasin）⑦Premix EX Taq DNA聚合酶⑧ PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1 RNA的反转录采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6µL（需加入RNA约1μg）OligodT primer 1µLH2O（nuclease-free）5µL12µL65℃ 5min，补加下列试剂：5× Reaction buffer 4µLRibolockRNase Inhibitor 1µL10mM dNTP Mix 2µLRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1µL20µL42℃ 60min70℃，5min，﹣20℃保存3.2. 2 PCR 扩增目的基因用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）2×PCR Mix 12.5µL 95℃ 1min95℃ 10s 58℃ 20s 72℃ 45s 72℃ 10min 16℃∞cDNA 1µL 引物GA22PDH1-1 1µL 引物GAPDH1-2 1µL H 2O 9.5µL total 25µLPCR 产物经胶回收。
4．核酸琼脂糖电泳分析 4.1 试剂① TAE 缓冲液（50×）：用时需稀释50倍 ② 点样缓冲液Loading buffer （10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油 ③ 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶，注意EB 具致癌作用。
④ 琼脂糖 4.2 操作步骤4.2.1 琼脂糖凝胶的制备称1g 琼脂糖加入100ml TAE 缓冲液中加热熔化。
4.2.2 胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。
然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE 缓冲液），拔掉梳子。
注意：缓冲液要高出胶面2mm 。
4.2.3 点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer （10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。
4.2.4 电泳接通电源，80V 电压电泳40min 左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2㎝处时停止电泳。
4.2.5 观察及照相将凝胶取出，在EB 溶液中浸泡10min 后，用凝胶成像系统照相。
5.pGEX 4T-1质粒的提取5.1 实验材料含质粒的大肠杆菌 5.2 试剂质粒提取试剂盒(天根生物科技)35cycles5.3操作步骤5.3.1培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上，37℃培养 24 h，然后从平板上挑取单菌落，接种于 5 mL 液体培养基中，37℃培养 12 h。
5.3.2提取步骤①柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500µL 的平衡液 BL，12,000rpm（~13,400×g）离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）②取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（~13,400×g）离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
③向留有菌体沉淀的离心管中加入 250µL 溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
④向离心管中加入 250µL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。
⑤向离心管中加入 350µL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm（~13,400×g）离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。
⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。
12,000rpm（~13,400×g）离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将⑦吸附柱 CP3 放入收集管中。
⑧向吸附柱 CP3 中加入 600µL 漂洗液 PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。
⑨重复操作步骤 7。
⑩将吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心 2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
⑪将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100µL 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000rpm（~13,400×g）离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。
5.3.3琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA6表达载体和目的片段的酶切6.1试剂①BamHⅠ②SalⅠ③BamHⅠ buffer④质粒提取试剂盒6.2操作步骤6.2.1在 LB 液体培养基中接入带pGEX 4T-1 质粒的菌种，在 37℃下 200rpm 摇菌过夜。
参见实验 8 的方法提取质粒。
7载体和外源 DNA 的连接反应7.1试剂①目标 DNA 片段（PCR 扩增产物）②载体（pGEX 4T-1 酶切回收产物）③10×ligation 缓冲液④T4 DNA 连接酶⑤ddH2O7.2操作步骤8感受态细胞的制备及转化8.1实验材料大肠杆菌 Top 10 或 BL21（DE3）PlysS8.2试剂① LB 培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录 2）②氨苄青霉素8.3操作步骤8.3.1感受态的制备①从 LB 平板上挑取单克隆于 5ml LB 培养基中，37℃ 200rpm 摇菌 12～16h。
②将活化过的菌按 1～5％的体积比接种到新的 LB 液体培养基中，37℃ 200rpm 摇菌约 2h，OD 600 约为 0.4。
③取 1.5ml 摇好的菌液于一个1.5ml 的 EP 管中，4℃4000rpm 离心 3min，弃上清。
④加 250µL 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃ 6000rpm 离心 1min 弃上清。
⑤加 200µL 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。
置于 4℃存放。
12h 内使用效果最佳。
注意：无菌操作和保持低温。
培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。
如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。
8.3.2转化①将盛有感受态细胞的 EP 管放置于冰上 10min，加入 10µL 连接产物（若加质粒，则只需加 1µL），温和混匀，冰浴 20~30min。
②42℃热激 90S。
冰浴 5~10min。
③加入 800µL LB 液体培养基，37℃培养 45～60min。
4000rpm 离心 2min，弃去800µL 上清液，剩余混匀用来涂板。
④取含有 50～100g/ml Amp 的 LB 平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布 4µL 200mg/ml 的 IPTG 和 40µL 20mm/ml 的 X-Gal），涂板。