基因工程实验(答案)
基因工程(李立家)小题目及答案
基因工程试题及答案1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。
带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。
使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。
1）切口平移标记: 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH 末端（这条链即成为引物）。
DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)2）随机引物标记: 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。
DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。
3) PCR标记: 针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针4）末端核苷酸转移法:P32和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA。
先用碱性磷酸酶处理去除DNA 5’的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏5'-磷酸的DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。
补充：1）常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛2）应用：定性（是否转入该基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源）2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。
）（1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。
组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）（2）PCR技术的原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
基因工程习题
基因工程习题及参考答案02工具酶部分——限制性内切核酸酶一、填空题1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2．年Luria 和Human 在T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3．1970 年，Smith 和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA 杂合双链。
这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA 片段或的DNA片段。
作用时需要作辅助因子，但不需要和。
6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1)(2) 。
7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。
根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8．EcoK 是I 类限制性内切核酸酶，分子组成是α2 β2 γ，分子量300kDa。
在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。
9．个体之间DNA 限制性片段长度的差异叫。
10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11．限制性内切核酸酶Acy I 识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释：（10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交：将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上，然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术，该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端：双链DNA被限制性内切酶切割后，形成得两条链错开几个碱基，而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交：将RNA进行变性电泳后，再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术，可用于检测目得基因得转录水平。
转位：一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程：在体外，用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA，继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞，最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程，又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中，那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器：人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段，连接到目得基因得两端，便于基因重组中得切割与连接。
转化：受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应：PCR中后期，随着目得DNA扩展产物逐渐积累，酶得催化反应趋于饱与，DNA 扩增产物得增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽），该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程（实验题目的总结）答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。
2.如何正确使用微量移液器（自己写的）答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。
3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么答：loading Buffer。
主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。
溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。
4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。
（题目有歧义）答：①取琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。
5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响（实验书P75）答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否；6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么（实验书P31）答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。
7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。
高考复习：人教版高中生物选修三现代生物技术专题一《基因工程》经典例题创新应用训练含答案解析
高中生物选修三现代生物技术专题全套教学案含单元检测专题一基因工程本专题包括基因工程的发展过程；DNA重组技术的基本工具；基因工程的基本操作程序；基因工程的应用；蛋白质工程的崛起等部分。
b5E2RGbCAP基因工程是一门20世纪70年代以来新兴的生物科学与工程技术相结合的科学。
也叫DNA重组技术。
它是按照人类的意愿，将某种基因有计划地转移到另一种生物中去的新技术。
现已成为生命科学中发展最快、最前沿的学科，有关生物工程的内容，己成为近几年生物高考的热点内容。
其中基因工程的操作工具和基因工程操作的基本步骤以及基因工程的成果及应用前景将是近年命题的新热点plEanqFDPw基因工程操作的三种基本工具，四项基本操作程序等内容将成为考查学生分析综合问题能力的材料；另外，针对生物工程在医药、食品、农林等高新技术产业中的应用，运用有关的生物知识指导生产和实践，对有关的生产方案、生产过程进行分析、综合评价，这也是高考的另一热点。
有关基因工程的备考，今后高考中可能涉及到本考题的热点问题，有如下几个方面：DXDiTa9E3d1•基因工程的基本步骤：目的基因的获取、基因表达运载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因表达的检测与鉴定几个步骤。
RTCrpUDGiT2•转基因技术的应用：（1）转基因动植物，如抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂，抗倒伏的植物；产肉、产蛋量高、生长快、耐粗饲料的动物；此外，转基因动物为人类异体器官移植提供了可能。
（2）基因药物：如人造胰岛素、人造生长激素、溶血栓的尿激酶原等。
（3）基因治疗：美国对复合型免疫缺陷症的治疗；糖尿病的治疗：许多科学家希望利用基因工程手段将正常的合成胰岛素基因导入患者体内，并准确表达，以此来修复或替代失去正常功能的胰岛B细胞，从而维持机体血糖平衡。
（4）利用遗传工程培养转基因固氮绿色植物的展望。
地球上的固氮途径有三条：生物固氮、工业固氮、高能固氮。
其中，生物固氮是植物可利用氮的主要来源。
基因工程实验
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五、实验注意事项
1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，否则易溢出
2 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变 形，并减少漏胶的机会
加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清
加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙 醇，混匀。
置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至 数个小时
11
12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，
用移液枪尽可能除去酒精
用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉 酒精
3
当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿 处理，可除残留蛋白质
真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条 件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成 缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
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2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异 丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去 盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实 验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于 浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要 在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如 NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙 醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐 类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处， 不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品 容积的95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积 较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同 时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶 解损失
高考生物《基因工程》真题练习含答案
高考生物《基因工程》真题练习含答案1．[2024·山东卷]关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是()A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰答案：A解析：研磨后，可以将研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，可以不使用离心机，A正确，B错误。
鉴定过程中的沸水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误。
该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加DNA的对照组，D错误。
2．[2023·新课标卷]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。
限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接答案：C解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。
3.[2023·浙江6月]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。
基因工程测试题(附解析)
基因工程测试题（附解析）一、基础题点练1．(2019·徐州模拟)已知限制性内切酶Xma Ⅰ和Sma Ⅰ的识别序列分别为C CCGGG 和CCC GGG。
有关这两种酶及应用的叙述，错误的是()A．这两种酶作用的底物都是双链DNAB．DNA 中出现这两种酶识别序列的几率不同C．Xma Ⅰ切割DNA 形成的黏性末端是—GGCCD．使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等解析：选B 限制酶作用的底物是双链DNA 分子；这两种限制酶作用的核苷酸序列相同，所以这两种识别序列在DNA 中出现的的几率相同；根据碱基互补配对原则，CCCGGG 的互补链是GGGCCC，并根据Xma Ⅰ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—CCGG；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等。
2．如图表示的是三种黏性末端，下列说法正确的是( ) ↓↓A．图中所示黏性末端是由同种限制酶切割形成B．若图甲中的G 碱基处发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点C．图中所示黏性末端是限制酶断开氢键形成D．目前常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等几类原核生物GAATTC 解析：选B 产生甲黏性末端的限制酶的识别序列为CTTAAG =====，产生乙黏性末端的限制酶CAATTG CTTAAG 的识别序列为GTTAAC =====，产生丙黏性末端的限制酶的识别序列为GAATTC =====，可见甲、乙、丙黏性末端是由3种限制酶作用产生的；限制酶具有专一性，能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，如果甲中的G 发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点；图中所示黏性末端是限制酶断开磷酸二酯键形成的；质粒是环状DNA 分子，噬菌体和动植物病毒都没有细胞结构，它们都不属于原核生物。
3．下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是()A．蛋白质工程的基础是基因工程B．蛋白质工程遵循的原理包括中心法则C．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构D．蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子解析：选C 蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造，或合成新的蛋白质，故蛋白质工程的基础是基因工程；蛋白质工程遵循的原理包括中心法则；蛋白质工程是通过改造基因来实现对蛋白质分子的改造的；蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子。
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——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结）
答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。
2.如何正确使用微量移液器？（自己写的）
答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。
3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？
答：loading Buffer。
主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。
溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。
4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。
（题目有歧义）
答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；
②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。
5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75）
答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否；
6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31）
答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。
7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？
答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。
8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？
答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl
9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。
答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。
10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
DNA聚合酶）。
答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，经高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤合成特异DNA片段。
（2）Mg2+：TaqDNA聚合酶的活性需要；dNTP：作为底物；引物：作为延伸的出发点；DNA：模板；缓冲液：维持反应环境的PH值；TaqDNA聚合酶：催化DNA的合成。
11.PCR循环次数是否越多越好，为什么？
答：否。
因为PCR产物的积累存在平台效应。
12.降低退火温度，延长变性时间对PCR结果有什么影响？
答：前者会使非特异性产物增多；后者会导致酶的活性降低。
13.如果检测的PCR结果中出现很多非特异性条带，可能有哪些原因导致？
答：①引物特异性不强；②Mg2+浓度过高；③引物二聚体形成；④退火温度过低；⑤循环次数过多。
14.简述DNA片段回收纯化的原理。
（？）
答：各DNA片段的大小不同，则经琼脂糖凝胶电泳后得到了分离，收集含有DNA的凝胶部位通过溶解凝胶、使DNA与硅胶柱结合、再通过洗涤杂质、最后DNA洗脱，通过新的EP管收集等，最终得到纯化的目的。
15.为什么DNA体外连接反应反应要设在16℃？
答：因为此温度下能最大限度的发挥连接酶的活性，同时有助于维持短暂配对结构的稳定。
16.简述TA克隆试剂盒进行体外连接的原理。
（实验书P149）
答：经DNA聚合酶得到的PCR产物——双链DNA片段的末端具有一个突出“A”碱基，而T载体每条链的3’端带有一个突出“T”碱基，则其两端可以与PCR产物的两端进行正确的T--A配对，再在连接酶的催化下，即可将目的片段连接到载体上，形成重组载体。
17.简述氯化钙制备感受态细胞的原理。
（实验书P153）
答：经低温预处理的低渗CaCl2溶液处理受体细胞后，则可使细胞的通透性增大，从而极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。
18.重组质粒的转化方法有哪些？
答：CaCl2法，电击法，农杆菌转染法；花粉管通道法，基因枪法等。
19.当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB 培养基上培养1h？
答：使感受态细胞复苏，同时让重组质粒在感受态细胞中适应并富集，以便于表达产物，使受体细胞具抗性能力。
20.什么情况下转化平板上会出现卫星菌落，为什么会出现卫星菌落？
答：涂布后的培养基培养时间过长。
因为载体上的抗性基因的表达产物由于培养时间过长而得到积累，使加入的抗生素失
效，从而让不含质粒的空菌落的一大量生长，故出现卫星菌落。
21.碱裂解细胞抽提质粒的基本原理是什么？
答：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解后，DNA和蛋白都发生变性。
当加入中和液后，由于构象上的区别，质粒DNA能较快的复性呈溶解状态，离心时留在上清液中，而染色体DNA不能复性，从而形成缠绕的网状结构并与蛋白凝聚，因离心沉淀。
22.电泳检测提取的质粒是会看到三条带，这三条带分别代表了什么？
答：最前端为超螺旋，中间为开环DNA，最后为复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
23.质粒抽提中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？
答：溶液Ⅰ——使沉淀重新悬浮；溶液Ⅱ——让染色体DNA和质粒DNA变性；溶液Ⅲ——中和碱，使质粒DNA复性。
24.什么是限制性内切酶的星号活性？
答：在某些条件下，一种特异性识别序列的限制酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性。
25.细菌产生的限制性内切酶，为什么不对自己的DNA进行切割？
答：因为细菌能通过甲基化酶的甲基化作用保护自身的DNA不被相应的限制酶降解。
26.影响限制性内切酶的因素有哪些？使用工具酶时应注意什么？
答：（1）DNA样品中的污染物，如有机溶剂等；缓冲体系；温度；样品量。
（2）①酶量使用少，确认样品是否加入反应体系；②吸取各试剂时使用不同枪头，避免交叉污染；③控制反应体系中甘油量在10%以下，以防止星号活性；④保证取酶的操作在冰浴条件下进行。
操作考试：
１.制胶
２.点样电泳
３.依照给定的ＰＣＲ参数，在ＰＣＲ仪上设置程序。
４.切胶
５.超净工作台接种（切记：最后封膜）。