基因工程试验指导
实验指导书-基因工程
生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二OO 七年八月前言该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。
通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA 重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。
实验设置内容包括：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验），农杆菌介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。
本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。
教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。
本书可作为高等院校生物技术、生物科学等生命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。
目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化···································32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化·······································································83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定·······································································104、实验报告基本内容要求····························································································125、实验报告格式··········································································································13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运用PCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程相关研究奠定基础。
基因工程技术的实验室操作指南
基因工程技术的实验室操作指南基因工程技术是当代生物科学领域的重要技术之一，依靠该技术，科学家们能够对生物体的基因进行修改和编辑，从而改变其性状和特征。
为了确保实验的准确性和安全性，科学家们在基因工程技术的实验室操作中需遵循一系列的指南和标准。
本文将针对基因工程技术的实验室操作进行详细介绍。
实验室操作前的准备工作非常关键。
首先，实验室应具备相关的设备和材料，如PCR仪、电泳仪、恒温器、培养皿和试管等。
同时，实验室应确保符合生物安全标准，并配备必要的防护设施，如实验室白大褂、口罩、手套和安全护目镜等。
在开始实验之前，实验员应熟悉实验的流程和步骤，并将实验室设置为无菌环境。
基因工程技术的一个重要步骤是基因克隆。
在进行基因克隆实验时，实验员应遵循以下步骤：1. DNA提取：从所需的生物体中提取DNA样本。
可以通过使用商业化的DNA提取试剂盒或自制试剂盒来实现。
2. PCR扩增：设计引物并进行PCR扩增，以扩增想要克隆的基因片段。
确保PCR反应体系中酶和引物的质量和浓度合适。
3. 凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA分子量标准一同在凝胶上进行电泳，以分离并检测所需的基因片段。
4. 净化PCR产物：使用商业化的PCR产物净化试剂盒或其他方法去除PCR反应中的杂质，得到纯净的PCR产物。
5. 酶切和连接：使用限制性内切酶切剪基因片段，然后与质粒载体进行连接。
确保酶切体系和连接试剂的合理选择和操作。
6. 转化：将连接好的质粒转化至宿主细胞中，如大肠杆菌。
通过热激或电激等方法，使质粒得以进入宿主细胞，从而实现基因的转移和表达。
另一个重要的基因工程技术是基因编辑。
下面是基因编辑实验的步骤：1. 选择编辑工具：选择合适的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统。
设计合适的引物和寡核苷酸（gRNA）序列，与Cas9蛋白结合来识别和切割特定的基因序列。
2. gRNA合成与转染：合成gRNA并将其转染至需要编辑的目标细胞中。
基因工程实验报告
基因工程实验报告一、实验目的：本实验旨在掌握基因工程的基本操作技能，了解DNA的提取、PCR扩增和基因克隆等基本实验过程，并通过实际操作检测转基因植物的存在。
二、实验原理：1.DNA提取：采用传统的CTAB法提取植物基因组DNA，目的是获得待测植物样品中的基因组DNA。
2.PCR扩增：选用合适的引物，利用PCR技术将待测基因扩增出来。
PCR反应中需要设置阳性对照、阴性对照和试验样品，以确定PCR扩增结果的可靠性。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因与质粒载体进行连接，再将重组质粒导入大肠杆菌进行转化培养，最后通过酶切和测序等方法验证目标基因的克隆成功与否。
三、实验步骤：1.DNA提取：将待测植物样品加入CTAB提取缓冲液中，酶解并脱脂植物细胞，通过乙酰酚/氯仿法提取总DNA。
2. PCR扩增：设计合适的引物，进行PCR反应。
反应条件通常为94℃预变性5min，然后循环20-35次，每次循环包括94℃变性30s、56-68℃退火30s、72℃延伸1-2min，最后72℃延伸10min。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因进行酶切，并与质粒载体进行连接，然后转化大肠杆菌进行培养。
通过PCR重放大和酶切验证目标基因是否成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序等方法对目标基因进行验证，判断基因克隆是否成功。
四、实验结果与分析：1.DNA提取：从待测植物样品中成功提取到总DNA，并进行酶切分析，可见DNA带状条带。
2.PCR扩增：通过PCR扩增，得到了目标基因的特异性条带，并且也验证了阳性对照和阴性对照的准确性。
3.基因克隆：通过酶切和重放大等方法验证了目标基因的成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序结果，确认目标基因与已知序列一致，说明基因克隆成功。
五、实验结论：通过本实验，我们掌握了基因工程的基本操作技能，成功进行了DNA提取、PCR扩增和基因克隆等实验过程，并通过测序等方法验证了目标基因的克隆成功。
基因工程实验技术操作手册
基因工程实验技术操作手册一、实验前准备在进行基因工程实验前，需要做好以下准备工作：1. 实验室环境准备：确保实验室设备完好，工作台面干净整洁，通风良好。
2. 实验材料准备：准备所需的试剂、培养基、细胞培养物等实验材料，并按照要求进行储存和标识。
3. 实验仪器准备：检查并确保实验所需的仪器设备正常运作，如PCR仪、电泳仪等。
4. 个人防护准备：佩戴实验室必备的个人防护用品，如实验手套、实验服、护目镜等。
二、实验步骤1. DNA提取a. 准备待提取的生物样本，如细菌、植物组织等。
b. 使用DNA提取试剂盒按照说明书进行提取步骤，如细胞破碎、蛋白质沉淀等。
c. 最后得到纯净的DNA样品，可用于后续的实验操作。
2. PCR扩增a. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。
b. 将反应体系加入PCR仪中，设置好扩增程序和参数。
c. 进行PCR扩增反应，得到所需的目标DNA片段。
3. DNA连接a. 准备连接试剂盒，包括连接酶、连接缓冲液等。
b. 将目标DNA片段和连接载体按照比例混合，加入连接试剂中。
c. 进行连接反应，使目标DNA片段与载体DNA连接成一个完整的质粒。
4. 转化a. 准备感受态细胞，如大肠杆菌等。
b. 将连接后的质粒DNA加入感受态细胞中，进行热激转化或电转化。
c. 将转化后的细胞涂布在含有适当抗生素的培养基上，培养过夜。
5. 筛选与鉴定a. 从培养基中挑取菌落，进行PCR扩增或酶切检测，筛选含有目标基因的菌落。
b. 对筛选出的菌落进行测序，验证目标基因的正确性。
c. 进一步进行功能鉴定，如蛋白表达、酶活性等实验。
三、实验注意事项1. 操作时要严格遵守实验室安全操作规程，注意个人防护和废弃物处理。
2. 实验材料的储存和标识要清晰明确，防止混淆和污染。
3. 仪器设备的操作要正确，遵循使用说明书，避免操作失误和设备损坏。
4. 实验步骤中的温度、时间等参数要按照要求进行调整和控制，确保实验结果的准确性。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程实验的详细步骤
基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
基因工程实验
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五、实验注意事项
1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，否则易溢出
2 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变 形，并减少漏胶的机会
加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清
加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙 醇，混匀。
置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至 数个小时
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12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，
用移液枪尽可能除去酒精
用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉 酒精
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当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿 处理，可除残留蛋白质
真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条 件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成 缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
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2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异 丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去 盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实 验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于 浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要 在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如 NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙 醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐 类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处， 不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品 容积的95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积 较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同 时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶 解损失
基因工程实验设计
基因工程实验设计实验目的：研究基因A对植物生长和抗逆能力的影响。
实验设计：1. 选取模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为实验材料。
这是因为拟南芥具有短的生命周期和相对较小的基因组，易于操作和研究，更适合用于基因工程实验。
2.首先，从拟南芥中提取基因A的DNA序列，并利用PCR技术扩增得到基因A的片段。
此外，还需要设计引物，引导基因A的扩增。
同时，设计一个空载体作为对照组。
3.将扩增得到的基因A片段与基因工程载体连接，形成重组载体。
将重组载体转入大肠杆菌中，利用大肠杆菌的复制和表达机制，大量复制和表达基因A。
4.鉴定大肠杆菌中的重组载体，通过PCR、酶切和测序等方法确认基因A已经成功插入载体。
5.利用凝胶电泳和转形方法将基因A载体转入拟南芥的叶片细胞中。
将转化得到的拟南芥幼苗移栽到含有基本培养基和适当浓度抗生素的培养基中，以筛选带有基因A的转基因植株。
6.对转基因植株进行PCR检测，确认基因A已经整合到拟南芥的基因组中。
7.比较转基因植株和野生型植株的生长情况，包括根长、茎长和叶片数量等方面。
利用统计学方法对结果进行分析。
8.在正常条件下进行水分、盐分和低温等逆境胁迫试验，比较转基因植株和野生型植株的抗逆能力。
利用统计学方法对结果进行分析。
9.可选的可以在抗逆胁迫下收集转基因植株和野生型植株的RNA样品，利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测基因A的表达水平，并进一步分析基因A在抗逆过程中的作用。
10.结果分析：根据实验数据和统计学分析，比较转基因植株和野生型植株的生长情况和抗逆能力，评估基因A在植物生长和抗逆过程中的作用。
最后，通过以上实验设计，可以得到对基因A在植物生长和抗逆能力中的作用有一定了解的结果。
实验结果可以为进一步研究基因A功能、植物育种等领域提供理论和实验依据。
同时，也有助于理解基因工程技术在农业、生物医学和环境等方面的应用。
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《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。
该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内3. 3.2pMD18-T载体pMD18-T载体是线状DNA，2.7kb，3’端有oligo(dT)，可插入PCR扩增产物。
插入位点两侧有常用的限制性内切酶酶切位点和T7、SP6 RNA聚合酶转录起始位点。
带有氨苄青霉素抗性基因，见图2。
图2 含有氨苄青霉素抗性的pMD18-T载体3. 4 试剂盒质粒小量抽提试剂盒购自安比奥生物技术公司；琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京TIANGEN公司；无内毒素质粒大量抽提试剂盒购自北京TIANGEN公司；DNA Ligation Kit Ver.2购自大连TaKaRa生物公司。
3. 5 其他试剂琼脂糖粉（Agar A）购自上海Yito公司；氯化钠、异丙醇和丙三醇购自长沙分路口塑料化工厂；无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂；胰蛋白胨（Trytone）、酵母提取物（Yeast Extract）、琼脂糖（Agar M）购自加拿大BBI公司；EB染液购自深圳市达科生物技术有限公司。
3. 6 DNA分子量MarkerDNA ladder mix #SM0331（深圳晶美公司）DNA ladder 100 bp #SM0321（深圳晶美公司）DNA ladder 100 bp #SM0241（深圳晶美公司）3.7 PCR引物CMLC2 启动子上游引物（CMLC2-L），下游引物（CMLC2-R）序列如下：CMLC2-L：5’-GAATTCAATGAGCTCTCCAAATCAGCAG-3’(划线部分为Eco R I酶切位点)CMLC2-R：5’-GGATCCGAGGAAACCGATTGCTACAAACC-3’(划线部分为Bam H I酶切位点)3.8主要仪器PCR仪，低温高速台式离心机，fresco离心机，SHINADZU电子天平，超净工作台，ZF-90型暗箱式紫外透射仪，DYY-III 8B型稳压稳流电泳仪，微波炉，XK96-A快速混匀器，GBII240-89不锈钢电热恒温水浴锅，电热恒温鼓风干燥箱，HX-1050恒温循环器，隔水式电热恒温培养箱，GIS-1000数码凝胶图象分析系统，6031-000-012核酸蛋白定量仪（Biophotometer），超纯水仪，紫外分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，恒温摇床，SCOTSMAN 制冰机，荧光显微镜，37℃细胞培养箱。
四、基本方法4.1转化实验4.1.1大肠杆菌感受态的制备（1）从-80℃冰箱中将E.coli DH5α菌种取出解冻，用未加抗生素的LB培养皿划线，37℃培养过夜；（2）挑取单个菌落入3ml LB（未加抗生素）液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜；（3）取过夜菌液0.5ml接种于50mlLB培养液中，37℃剧烈振荡培养2-3h；（4）冰浴10min，然后4℃、5,000rpm离心5min；（5）弃上清，加25ml预冷的100 mmol/L CaCl2，悬浮菌体；（6）冰浴30min，然后4℃、5,000rpm离心5min；（7）弃上清，加3.3ml预冷的100 mmol/L CaCl2，悬浮菌体；（8）4℃放置12h后加入终浓度为15%的无菌甘油，按70μl分装，-80℃保存备用。
4.1.2 培养基的配制液体培养基：Trytone 5g，NaCl 5g，Yeast Extract 2.5g，加水至500ml。
固体培养基：Agar A 7.5g，Trytone 5g，NaCl 5g，Yeast Extract 2.5g，加水至500ml。
4.1.3 转化步骤（1）将感受态细胞置于冰上，将一半体积的连接子加入感受态细胞，混匀，冰上放置30min，另一半连接子-20℃保存备用；（2）42℃水浴60-90s热休克；（3）迅速冰上冷却3-5min；（4）加入1ml液体LB（不含抗生素），37℃摇床培养1h；3,000rpm离心2min；（5）吸去上清700μl，剩余300μl混匀，一半用于涂板，另一半4℃储存备用；（6）150μl菌液涂布于含Kana（25μg/ml）或Amp（50μg/ml）的固体LB平板表面（平板已预热），37℃正置培养30min，倒置培养过夜。
4.1.4阳性克隆的筛选与鉴定用无菌吸头挑单个菌落至含抗生素的液体培养基中，200r/min，37℃振荡培养过夜。
PCR初步检测阳性克隆后，提取质粒DNA进行双酶切鉴定。
4.2 质粒DNA的小量抽提按安比奥公司质粒DNA小量抽提试剂盒操作手册进行：（1）大肠杆菌的培养：从平板上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养；（2）取1-4.5ml的过夜培养菌液，10,000rpm离心1min收集菌液于1.5mlEP管内；（3）将细菌重悬于250μl Buffer PB1（已加入附赠的RN ase）,涡旋震荡，使细菌充分分散;（4）加入250μl Buffer PB2，轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液，一般反应时间不要超过5min；（5）加入350μl Buffer NB3，轻轻地上下翻转混合5-6次，直至形成絮状沉淀，然后室温静置3-5min；（6）14,000rpm离心10min，将上清转移到含收集管的离心柱内，12,000rpm离心1min，倒去收集管内的废液，并将离心柱重新放入收集管内;（7）加入500μl Buffer PB4于离心柱内，12,000rpm离心1min，倒去收集管内的废液，并将离心柱重新放入收集管内;（8）向离心柱内加入750μl Buffer WB(已加无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒去收集管内的废液，将离心柱放入收集管内;（9）重复步骤（8）一次;（10）13,000rpm空离心2min；（11）将离心柱置于干净的1.5mlEP管上，向滤膜中央滴加50μl的超纯水或洗脱液Buffer EB，室温静置2-3min；（12）12,000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存。
4.3 质粒DNA的大量抽提使用TIANGEN无内毒素质粒大量抽提试剂盒，步骤如下：（1）从小量制备并经酶切检验正确的菌种中挑菌，接种到含有抗生素的液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜；（2）菌液加至50ml离心管，4,000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；（3）加入2ml溶液I，70μl RN ase；（4）加入2ml溶液II，温和混匀，冰上静置2min；（5）加入8.6ml溶液III，温和混匀，室温放置2min；（6）转入50ml离心管中，12,000rpm离心12min，将上清液移入放置在50ml离心管上的回收柱内（注意勿吸沉淀），室温静置5min后，4,000rpm 离心2min，弃离心管中废液，再离心2min，弃废液；（7）在回收柱中加入5ml Wash Solution，4,000rpm离心2min，弃废液，重复一次；（8）4,000rpm离心2min；（9）将回收柱放在一个新的50ml离心管中，在回收柱中加入500μl Elution Buffer（预先在56℃加热以提高回收效率，且分两次加入，第一次加入300μl，离心后收集液体，再加入200μl收集液体），静置2min后，4,000rpm离心2min，回收目的质粒。
4.4小量胶回收DNA3.4.1 试剂配制TAE缓冲电泳工作液：40mmol/L Tris.Ac，2mmol/L EDTA。
1%琼脂糖电泳胶：0.5g琼脂糖，50ml H2O，1ml 50×TAE缓冲液，2μl EB溶液。
电泳缓冲液：8ml 50×TAE，加水至400ml。
4.4.2 纯化步骤按TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒操作手册进行:（1）取质粒大酶切产物点样，75V电泳，跑胶90min；（2）在暗箱式紫外透射仪内切下含目的片段的胶装入已事先称重的1.5mlEP管中，并称重，注意每管胶不可超过0.4g；（3）加入胶的3倍体积的溶胶液PB(即0.1g的胶加入300μl的溶胶液)；（4）置于50℃恒温水浴数分钟，每几分钟混匀一次，以保证胶完全融化；（5）胶完全融化后将溶胶液冷至室温，再移入含收集管的回收柱，12,000rpm离心1min，倒去收集管中的废液；（6）加入700μl Wash Buffer (已加无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒去收集管中的废液；（7）加入500μl Wash Buffer (已加无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒去收集管中的废液；（8）13,000rpm空离心2min，尽量除去废液;（9）将回收柱室温放置数分钟，干燥;（10）将回收柱放入干净的1.5mlEP管中，向回收柱滤膜中央加入已预热（65℃-70℃最适宜）的Elution Buffer 30μl，室温放置2min；（11）12,000rpm离心1min，洗脱DNA；将洗脱的溶液重新加入回收柱，12,000rpm离心1min，以提高洗脱率。