基因工程》课程实验指导书
实验指导书-基因工程
生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二OO 七年八月前言该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。
通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA 重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。
实验设置内容包括：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验），农杆菌介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。
本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。
教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。
本书可作为高等院校生物技术、生物科学等生命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。
目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化···································32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化·······································································83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定·······································································104、实验报告基本内容要求····························································································125、实验报告格式··········································································································13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运用PCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程相关研究奠定基础。
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
基因工程实验手册
总论基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。
基因工程的基本技术是DNA 重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。
按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。
了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。
第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。
一、DNA体外重组的主要步骤DNA体外重组可分五个步骤。
(一)目的基因和载体基因的制备制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。
1．带有目的基因的DNA片段的获得带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。
从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对其进行酶切，获得特定的酶切片段。
酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。
化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。
目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的基因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一。
2．载体的选择DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子。
目前常用的载体类型有质粒、噬菌体和动物病毒等。
其中以质粒载体最常用。
质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，在细菌分裂时可伴随染色体分配到子细胞。
《基因工程》实验教学大纲
《基因工程》实验教学大纲课程编号:课程名称：基因工程英文名称： Genetic engineering课程类型: 专业必修学时： 18学时学分：适用对象: 生物技术本科专业先修课程：生物化学、分子生物学一、课程性质、要求、目的和任务（黑体，小4号字）1.课程性质生物科学专业必修课程，本课程需要以遗传学、生物化学、酶学、分子生物学等课程为基础。
2.基本内容本实验课程是以基因工程基本操作技术为主线，在强调实验方法经典性、实用性的前提下以鸡免疫抑制性受体克隆表达为例，使学生能够加深理解基因工程基本操作技术在具体科学研究中的应用，最终形成一个完整的理论体系。
实验内容涉及了基因工程的主要过程，以含鸡外周血单核细胞RNA反转录产物为模板，通过PCR技术扩增获得鸡免疫抑制性受体PD-1目的片段，通过胶纯化方法将目的片回收纯化，对其进行浓度及纯度的测定后连入T-simple 载体构建克隆载体，将PD-1-T载体导入大肠杆菌受体细胞后，通过菌液PCR的手段鉴定出阳性克隆并扩增培养，利用碱裂解法提取PD-1-T重组质粒，利用EcoRI、XhoI进行双酶切，并回收目的片段，将表达载体与目的片段PD-1连接，然后进行转化得到重组子，并用双酶切或菌液PCR方法鉴定阳性重组子，最终导入Rosetta表达菌株中进行诱导表达。
3.基本要求:本实验课在方法上，力求经典，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
4.目的及任务（1）通过本课程的实践操作，使学生掌握基因工程各环节的原理和操作技术（2）掌握质粒提取、分离、纯化、鉴定，DNA酶切、重组、连接，DNA扩增等技术（3）进一步增强学生的实验技能，包括常规仪器和基因工程有关仪器的使用，试剂的配制等。
（4）以具体科研课题为引，使学生了解科研动态并加深对基因工程技术的理解。
基因工程实验指导
《现代生物技术导论》实验指导书实验学时：32学时实验目录实验一ß-半乳糖苷酶基因（lac Z）的定点突变 (1)实验二外源目的基因片段回收与载体的体外连接 (6)实验三重组DNA分子的转化、筛选与鉴定 (9)实验四外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE检测 (12)实验一ß-半乳糖苷酶基因（lac Z）的定点突变实验项目类型：基础性所属课程名称：《现代生物技术导论》实验计划学时：6学时一、实验目的1. 学习并掌握利用PCR进行基因缺失和插入定点突变的基本原理和实验方法。
2. 复习碱法小量制备质粒DNA的原理和方法。
二、PCR介导的基因定点突变的基本原理pSV-β-半乳糖甘酶质粒pSV-β-半乳糖甘酶质粒基因分布SV40 Early promoter and enhancer segment 1-419Transcription start sites 354, 360, 365Possible start codons (ATG) 500, 530, 569gpt promoter (-10 region) 428-433lacZ start site 710lacZ stop site (TAA) 3755lac operon sequences 709-4020lacY 3809-4011SV40 small T antigen 4021-4156beta-lactomase (Ampr) coding region 4784-5644载体pSV-β-半乳糖甘酶大小是6820bp（图实验1-1），其上带有完整的lacZ 基因，其中lacZ基因的起始位点是710bp，终止位点是3755bp.通过改变5‘端引物或（和）3’引物中的核苷酸序列或数目，可利用多聚酶链式反应（PCR ）进行基因的定点突变。
本实验的定点突变均设计在5‘端引物上，而3’端引物上（4279-4302bp ）无突变。
基因工程实验技术操作手册
基因工程实验技术操作手册一、实验前准备在进行基因工程实验前，需要做好以下准备工作：1. 实验室环境准备：确保实验室设备完好，工作台面干净整洁，通风良好。
2. 实验材料准备：准备所需的试剂、培养基、细胞培养物等实验材料，并按照要求进行储存和标识。
3. 实验仪器准备：检查并确保实验所需的仪器设备正常运作，如PCR仪、电泳仪等。
4. 个人防护准备：佩戴实验室必备的个人防护用品，如实验手套、实验服、护目镜等。
二、实验步骤1. DNA提取a. 准备待提取的生物样本，如细菌、植物组织等。
b. 使用DNA提取试剂盒按照说明书进行提取步骤，如细胞破碎、蛋白质沉淀等。
c. 最后得到纯净的DNA样品，可用于后续的实验操作。
2. PCR扩增a. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。
b. 将反应体系加入PCR仪中，设置好扩增程序和参数。
c. 进行PCR扩增反应，得到所需的目标DNA片段。
3. DNA连接a. 准备连接试剂盒，包括连接酶、连接缓冲液等。
b. 将目标DNA片段和连接载体按照比例混合，加入连接试剂中。
c. 进行连接反应，使目标DNA片段与载体DNA连接成一个完整的质粒。
4. 转化a. 准备感受态细胞，如大肠杆菌等。
b. 将连接后的质粒DNA加入感受态细胞中，进行热激转化或电转化。
c. 将转化后的细胞涂布在含有适当抗生素的培养基上，培养过夜。
5. 筛选与鉴定a. 从培养基中挑取菌落，进行PCR扩增或酶切检测，筛选含有目标基因的菌落。
b. 对筛选出的菌落进行测序，验证目标基因的正确性。
c. 进一步进行功能鉴定，如蛋白表达、酶活性等实验。
三、实验注意事项1. 操作时要严格遵守实验室安全操作规程，注意个人防护和废弃物处理。
2. 实验材料的储存和标识要清晰明确，防止混淆和污染。
3. 仪器设备的操作要正确，遵循使用说明书，避免操作失误和设备损坏。
4. 实验步骤中的温度、时间等参数要按照要求进行调整和控制，确保实验结果的准确性。
基因工程实习指导书-0801081
基因工程实习指导书适用专业：生物技术周数：2周学分：2 编写人：陈英审定人：1实习目的植物遗传转化(genetic transformation)是指将外源基因导入植物细胞，获得转基因植物的技术。
自1983年第一株转基因烟草问世以来，二十多年来，转基因技术已得到长足的发展。
植物遗传转化方法是植物遗传转化的重要环节，迄今为止已建立了多种植物遗传转化体系和转基因技术。
归纳起来，包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、显微注射法等，其中农杆菌介导法是目前双子叶植物转基因最常用的方法。
通过本实习，学生进一步学习植物遗传转化的基本原理，了解植物遗传转化与检测的流程，掌握多种以根癌农杆菌位介导的植物遗传转化方法和技术。
2实习内容实验一拟南芥花序浸润转化拟南芥是自花授粉植物，具有高度纯合、植株小、生长周期短（从发芽到开花不超过6周）、结籽多和生活能力强的优势。
用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
所以拟南芥是进行遗传学研究的极好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
一、实验目的通过本实验，进一步学习农杆菌介导植物遗传转化的基本原理，掌握拟南芥花序浸润法遗传转化的流程。
二、实验原理农杆菌介导的基因转化利用的是一种能够实现DNA转移和整合的天然系统，即根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒。
Ti质粒经过改造，使之带有T-DNA的左右边界序列，左右边界序列间是多克隆位点，便于目的基因的插入。
将构建好的质粒转入农杆菌，然后再转入植物，目的基因通过T-DNA序列与植物受体细胞染色体DNA同源序列进行同源重组而整合。
通过选择标记筛选及分子检测，既可获得转基因植株。
三、实验材料拟南芥四、仪器设备1）剪刀、培养皿、三角烧瓶（高压灭菌，烘干）2）50ml离心管、2ml离心管、1ml枪头、200μl枪头（高压灭菌，烘干）3）超净工作台、摇床、离心机。
五、实验步骤1. 拟南芥种植：把种子悬浮在0.05% 琼脂糖中，黑暗中，4℃，放置3天，打破休眠。
基因工程实验指导书2资料
实验一、质粒DN A勺提取实验二、细菌基因组的提取实验三DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一、质粒DNA勺提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。
在基因克隆的实验中，要把一个有用的外源基因通过重组DN敍术,送进生物细胞中去繁殖和表达。
实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体，细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。
作为基因工程的载体需具备下列条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3）载体DNAS上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入;（4）载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因（Amp,抗新霉素基因（Neo R）等,以此判断载体是否进入受体细胞，并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来细菌质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型和松驰控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，与染色体复制相关联，每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如ColEI 质粒（含有产生大肠杆菌毒素EI基因）,PBR322就是ColEI衍生的质粒。
后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。
本实验分离纯化的质粒为PQE30为高拷贝质粒。
通过本实验学习了解质粒DNA勺特点,掌握碱性SDSfe速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA.、实验原理所有分离质粒DNA勺方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA勺纯化。
本实验以碱性SD缺速法小量制备PQE3质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞壁（小量制备可省略不用溶菌酶）,去污剂SD测使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNAE 性，但闭环质粒DNAI由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
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《基因工程》课程实验指导书生物技术专业黄淑坚黄良宗编写佛山科学技术学院2005年12月目录前言 (Ⅱ)实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1)实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7)实验三重组DNA的转化 (10)实验四重组DNA的鉴定 (13)实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16)实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18)附录 (22)参考文献 (34)前言基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。
本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。
编者2005年12月实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）一、目的和要求了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。
二、实验内容RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。
三、仪器、设备和实验准备1、仪器恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。
2、试剂反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。
3、实验准备用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。
四、实验原理RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。
反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。
反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。
它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。
（一）PCR反应中的主要成份：1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。
利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。
理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。
当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。
4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP 的不足出现的错误掺入。
3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。
4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。
一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5. Taq DNA聚合酶：在100μl P CR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。
酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。
(2) 加入10mmol/L 的EDTA螯合Mg2+。
(3) 99-100℃加热10min。
目前已有直接纯化PCR产物的试剂盒可用。
6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+. Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。
另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利，各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
（二）PCR反应参数1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。
变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量。
一般变性温度与时间为94℃ 1min。
在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
对于富含GC的序列,可适当提高变性温度，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度，实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。
一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。
退火温度越高, 所得产物的特异性越高。
有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用94℃和60℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。
退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
通常退火温度和时间为37℃-60℃,1-2min。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。
延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。
在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。
延伸时间过长会导致产物非特异性增加。
但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(7-10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。
一般而言25-30轮循环已经足够。
循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。
通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010。
五、实验步骤1 反转录反应（合成cDNA第一链）（1）依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20µl 的反应体系。
（依据RNA 的量，反应体积可以增减）：组分量, 25mM* 4µlMgCl2反转录10 X 缓冲液2µldNTP 混合物, 10mM 2µlRNasin® 核糖核酸酶抑制剂0.5µlAMV 反转录酶（高浓度） 15u上游引物或随机引物* 0.5µg总RNA 1µg加无核酸酶的水至终体积为20µl***注：* 推荐的MgCl2 浓度可根据已知序列进行优化以得到较高产量。