质粒酶切鉴定(精选)
实验三 质粒DNA的酶切鉴定课件PPT
5. 识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，
不能被切割。
2021/3/10
7
限制性内切酶的切割方式
内切酶切割后产生的三种末端
a) 5’ 突出的粘性末端 如, EcoR I 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’
b) 3’ 突出的粘性末端 如, Pst I 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’
• 影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实 验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间 与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。
• 酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总 体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确 定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较 好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL 。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+ 酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都 要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，离 心后保温酶切。
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
Xho Ⅱ
5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
2021/3/10
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
11
Sau3A
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
2021/3/10
9
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
第三次分子生物学实验报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、实验目的1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理1、重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
质粒DNA 酶切鉴定
实验五质粒DNA的微量提取及酶切鉴定字体:质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的环形双链DNA 分子。
一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。
1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。
对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。
但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。
（问题：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。
质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：a.大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。
b.从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA 是共价闭合的环状分子。
利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。
问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。
（1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。
尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。
（2）表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+），如HB101。
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一目的学习质粒的酶切及电泳分析。
二原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三试剂与主要仪器（一）试剂1．Eco RⅠ酶2．λ DNA3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5．溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6．琼脂糖（二）仪器1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱四操作步骤（一）质粒DNA酶切1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
管号①②③质粒DNA 10 10 10Eco RⅠ/ μl 1 1酶切Buffer（10×）/ μl 2 2 2ddH2O/ μl8 7 6RNA酶 1 2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。
然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
（二）琼脂糖凝胶电泳1 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。
冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件
实验目的
1、学习限制性内切酶的特性 2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法
高中教材分析
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特
异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的
重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶
等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴 定。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺 序，并在识别点附近 1000 bp 的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专 一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技 术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结外观察 分析仪 上观察酶切的结果。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能 形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取 决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的 缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
BglⅡ
19
5) 影响内切酶切割效率的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。
质粒
EcoR1
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型和特征 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1)寄主控制的限制与修饰现象 restriction modification system
酶切鉴定
质粒DNA的酶切鉴定 质粒DNA的酶切鉴定 DNA
Ampr
f1 ori LacZ pGEMmA1-5R (3204 bp)
D: Identify positive clone
3204 bp 3015 bp 189 bp
T7
189 bp
Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I
pGEM-xy1
Construction of pGEM-xy1
B: Primer of PCR:
PAP 5' GACCACGCGTATCGATGTCGAC mA5 5' GGCCAGGAGATTGAACTCAAG
Mouse cells X-gene cDNA PAP
189 bp mA5
C: The product of PCR
189 bp Ligation
Apa I Sph I Nco I Not I EcoRI
实验原理 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基 操作过程中所使用的基 限制性内切酶是 本工具。其特异性地结合于一段特殊 本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之 序列之 内或其附近的特异位点上，并在此切割双链 内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 。 分子克隆中常用的为II类限制酶， 分子克隆中常用的为 类限制酶，其识别位点长 类限制酶 度为4、 或 个核苷酸的反向重复序列 个核苷酸的反向重复序列。 度为 、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶 的切割点因酶而异，有些产生带平端的 片段， 的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段， 片段 而另一些产生带有粘性末端的DNA。 。 而另一些产生带有粘性末端的
《质粒酶切鉴定》课件
缓冲液
01
缓冲液是用来维持溶液的pH值在一个特定的范围内 ，以保护酶的活性。
02
在质粒酶切鉴定中，常用的缓冲液是TAE和TBE，它 们分别适用于不同类型的电泳。
03
缓冲液的主要成分是Tris、醋酸和EDTA等，这些成 分对酶切反应和电泳分离具有重要的作用。
分子量标记
分子量标记是一类已知大小的标 准分子，用于在电泳中作为参照 ，帮助确定未知分子的分子量。
验。
酶切的意义
鉴定目的基因
通过酶切鉴定，可以确定目的基 因是否存在于质粒中，以酶切和连接等手段，可以分析
通过酶切和Southern杂交等技术 ，可以对基因组DNA进行定位、 分析和比较等研究。
02
酶切工具及试剂
限制性内切酶
限制性内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸 之间的磷酸二酯键进行切割的酶。
限制性内切酶的活性依赖于DNA的特异性序列，它能识别并附着特定的核苷酸序列，并在特定的位点进 行切割。
限制性内切酶的切割位点是已知的，因此它被广泛应用于基因克隆、DNA分析和基因组学研究等领域。
05
注意事项
酶切温度控制
总结词
温度对酶活性影响显著
详细描述
酶切温度需要严格控制，过高或过低的温度都会影响酶的活性，导致酶切不完全或无酶切产物。通常，酶切反应 的温度设置在推荐的适宜温度范围内，以确保酶活性的最佳发挥。
酶切时间选择
总结词
时间影响酶切效率
详细描述
酶切时间的选择对酶切效率有重要影响。过短的酶切时间可能导致酶切不完全 ，而长时间的酶切可能导致非特异性切割。因此，需要根据酶的特性和底物浓 度合理选择酶切时间，以达到最佳的酶切效果。