转基因技术生产胰岛素
《转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究》范文
《转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，利用转基因克隆技术生产人胰岛素已成为研究热点。
通过将人胰岛素基因整合到牛乳腺细胞的基因中，我们能够在动物乳腺中实现高产量的人胰岛素生产。
这种方法不仅能够克服传统人胰岛素生产的局限，还可以减少人类对外部药物的依赖。
本文将详细探讨利用转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究进展和潜在应用。
二、研究背景与目的近年来，糖尿病已成为全球范围内的一个重大健康问题。
胰岛素作为治疗糖尿病的关键药物，其需求量巨大。
传统的胰岛素生产方法主要依赖于生物合成或从动物胰腺中提取，但这些方法存在产量低、纯度不稳定等问题。
因此，寻找一种高效、稳定且可持续的胰岛素生产方法显得尤为重要。
利用转基因克隆技术制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究，旨在解决上述问题，实现人胰岛素的高效生产。
三、研究方法本研究采用转基因克隆技术，通过将人胰岛素基因与牛乳腺细胞的基因整合，以实现人胰岛素在牛乳腺中的表达。
首先，研究人员通过基因工程技术将人胰岛素基因进行改造，以适应在动物细胞中的表达；其次，利用体细胞核移植技术对基因修饰后的细胞进行克隆处理；最后，通过动物生殖细胞的媒介实现胚胎移植并完成生产。
四、研究进展与成果经过深入研究与试验，本研究取得了以下重要成果：1. 成功构建了含有重组人胰岛素基因的转基因牛乳腺细胞模型，并通过体细胞核移植技术实现了转基因克隆牛的成功培育。
2. 通过对转基因克隆牛的乳腺进行检测，发现其能够稳定表达人胰岛素基因，并成功在乳腺中合成和分泌人胰岛素。
3. 通过对转基因克隆牛的长期观察和监测，证实了其生产的胰岛素在质量和纯度上均达到了临床使用标准。
五、潜在应用与价值本研究为糖尿病治疗提供了新的可能性和解决方案。
通过将人胰岛素基因整合到牛乳腺细胞中，我们可以在动物乳腺中实现人胰岛素的高效生产。
这种方法的优势在于其高产量、高纯度和稳定性，为解决全球糖尿病患者的用药问题提供了新的途径。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
《基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究》一、引言基因工程技术的发展为生物医药领域带来了革命性的变革，其中重组DNA 技术作为一种能够改变生物体基因组的技术，为生产重组蛋白素（包括重组人胰岛素）提供了可行性。
本文将从深度和广度两个方面来探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究。
二、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的原理在基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究中，首先需要获取重组人胰岛素的基因序列，然后以质粒或病毒为载体将其转染至大肠杆菌的体内，经过培养和发酵，大肠杆菌体内合成重组人胰岛素，并通过纯化后得到最终的产品。
三、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展1. 基因克隆技术的应用基因克隆技术的应用是基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的关键技术之一。
利用限制酶切剪切 DNA，然后重组连接，将重组的DNA 导入质粒内，再将质粒导入大肠杆菌细胞内，实现外源基因的表达。
2. 基因工程大肠杆菌的选择为了高效地生产重组人胰岛素，研究者需要筛选高产重组蛋白素的大肠杆菌菌株，并进行相关的改造以提高其产量。
3. 发酵工艺的优化发酵工艺的优化对于提高重组人胰岛素的产量至关重要。
包括对培养基成分、厌氧发酵条件、发酵时间等因素的优化。
四、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的意义基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素具有重要的生物医药意义。
大肠杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌，其发酵生产成本低、抗污染能力强，适用于大规模工业化生产。
另重组人胰岛素与天然胰岛素具有相同的生物活性，可以作为治疗糖尿病的药物，在临床上有着重要的应用前景。
五、个人观点和理解基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是基因工程技术的一个重要应用方向，其有着较高的生产效率和较低的成本，为生物医药领域带来了巨大的潜力和机遇。
但是，需要注意的是，基因工程技术在应用过程中也存在一些伦理和社会问题，例如生物安全性、环境影响等方面，需要引起足够的重视。
转基因技术的发现
转基因技术的发现一、引言转基因技术是指通过人工干预调整生物的基因组，使其获得新的或改进的性状。
这项技术自20世纪70年代开始发展，并在近几十年中得到了广泛应用。
本文将介绍转基因技术的发现及其历史背景。
二、历史背景1. DNA结构的发现1953年，Watson和Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型，这一重大发现为后来的转基因技术奠定了基础。
2. 限制酶的发现1970年代初期，美国斯坦福大学的科学家们首次发现了一种能够切割DNA分子特定序列的酶——限制酶。
这项发现为后来的转基因技术提供了必要工具。
3. 基因克隆技术的出现1972年，美国斯坦福大学教授Paul Berg首次使用限制酶切割DNA 分子，并将其插入到另一个细胞中。
这项实验被认为是基因克隆技术（gene cloning）的开端。
4. 转基因动植物研究的开展1983年，美国科学家Michael Bevan首次将外源基因转移到拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，并使其表达出新的性状。
这是第一次成功地将外源基因转移到植物中。
5. 转基因动物的研究1985年，英国爱丁堡大学的科学家们首次成功地将外源基因转移到小鼠中，并使其表达出新的性状。
这项实验被认为是第一次成功地将外源基因转移到动物中。
三、转基因技术的发现1. 转化法1983年，美国科学家Herbert Boyer和Robert Swanson共同创立了Genentech公司，并开展了人类胰岛素的生产工作。
他们使用了一种称为“转化法”的技术，将人类胰岛素的基因插入到大肠杆菌（Escherichia coli）中，使其表达出人类胰岛素。
2. 构建质粒1984年，美国科学家Marc Van Montagu和Jeff Schell在拟南芥中构建了一个名为Ti质粒的DNA分子。
该质粒能够将自身插入到植物细胞中，并使其表达出新的性状。
3. 基因枪法1987年，美国科学家John Sanford和Edward Wolf首次使用基因枪（gene gun）将外源基因转移到玉米中，并使其表达出新的性状。
生物转基因胰岛素
在一次模拟考试中有一道试题需判断能否将胰岛素基因导入大肠杆菌用来生产胰岛素。
教材中明确提到：1978年，科学家将人体内能够产生胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA重组，并且在大肠杆菌内获得成功的表达（必修②第104页）。
但让大部分同学及一些老师感到疑惑的是：大肠杆菌是原核生物，既没有内质网，也没有高尔基体，而胰岛素是分泌蛋白，大肠杆菌是怎样加工和分泌胰岛素的呢？2．我国人工合成牛胰岛素的艰辛历程众所周知我国科学家率先合成具有生物活性的结晶牛胰岛素，回顾我国人工合成牛胰岛素的艰辛历程，对认识将胰岛素基因导入大肠杆菌，能用于生产胰岛素这一正确的结论有重要意义。
1958年确定人工合成胰岛素的课题。
胰岛素是由三对二硫键，其中两对二硫键在A链和B链之间形成，另一对二硫键在A链上。
在考虑的合成各种合成方案中，最切实可行的方案是分别合成A链和B链，然后通过巯基的氧化使两条链正确组合。
邹承鲁所在小组的任务是摸索胰岛素分子经过还原、分离纯化之后得到的A链和B链怎样重新组合成天然的胰岛素分子。
历经艰辛，最终发现了不使用氧化剂而是在低温下由空气缓慢氧化的方法完成。
所得到的粗产物经进一步纯化和结晶，终于得到和天然胰岛素具有相同活力和晶型的晶体。
并且胰蛋白酶水解物双向纸层析和电泳的结果进一步证实氧化后所得的胰岛素与天然胰岛素完全相同。
（我国科学家在1959年秋得出这些重要的结论，后来被国外其它实验室证实。
现已应用到工业生产中。
）上海生物化学研究所由钮经义和龚岳亭领导的小组负责B链的合成，上海有机化学研究所由汪猷领导的小组以及北京大学由邢其毅领导的小组共同负责A链的合成，两条链都是通过传统的片段缩合法来合成。
邹承鲁领导的小组负责两条肽链的组合。
B链的合成以及由人工合成的B链与天然的A链构建成胰岛素首先获得成功。
A链的合成一直不顺利，龚岳亭加入到上海有机化学研究所的小组中帮助解决了问题。
在1965年9月17日，中国在世界上首次用人工方法合成了结晶牛胰岛素。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
转基因技术生产胰岛素
胰岛素结构
胰岛素含有三对二硫键， 其中两对二硫键在A链和 B链之间形成，另一对二 硫键在A链上。
合成方法ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
长期以来，人们已开发了多种大肠杆菌工程菌，但具有代表性和实用型的构 建方案主要有以下三种。
参考文献
酵母表达基因工程产物不均一性分析及其对策 王洪海，高卜渝 - 《中国科学:化学》 - 1994 - 被引量: 42 毕赤酵母高效电转化方法的探讨 张艳，杨清武，吕凤林 - 《中国修复重建外科杂志》 - 2002 - 被引量: 15 胰岛素原的基础和临床研究 骆天红 - 《国际内分泌代谢杂志》 - 1995 - 被引量: 15 人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达 房德兴，王永山 - 《中国生物化学与分子生物学报》 - 1998 - 被引量: 12 单链胰岛素前体在酵母中的分泌表达及其转变成人胰岛素 朱尚权，徐明华，许英镐，... - 《中国科学:生命科学》 - 1997 - 被引量: 10 人胰岛素原类似物(BKRA)基因三联体的构建与表达 房德兴，周宗安，翟春生，... - 《药物生物技术》 - 1999 - 被引量: 10 重组单链胰岛素的连接肽与其生物功能的关系 黄一丁，梁镇和，冯佑民 - 《中国科学:》 - 2001 - 被引量: 7
➢AB链同时表达法
将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β—半 乳糖苷酶基因的下游。采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体 外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。
最新研究成果
第三代胰岛素
速效胰岛素：新型超短效胰岛素，吸收和起效时间更 快，患者不再受到“提前30分钟”的制约，使用胰岛 素更加灵活方便，大大减少了漏用或重复用药的潜在 风险。
基因工程与转基因技术
基因工程与转基因技术基因工程与转基因技术是现代生物科学领域的重要研究方向，它们对于人类的生活和健康有着深远的影响。
本文将从基因工程和转基因技术的定义、应用领域、优势与风险等方面进行探讨。
一、基因工程的定义与应用领域基因工程是指通过改变生物体的遗传物质，使其具有特定的性状或功能。
它主要包括基因的克隆、基因的定点突变、基因的插入和基因的删除等技术手段。
基因工程的应用领域非常广泛，涉及医学、农业、工业等多个领域。
在医学领域，基因工程可以用于疾病的诊断和治疗。
例如，通过基因工程技术可以制备出大量的重组蛋白，用于生产药物，如胰岛素、生长激素等。
此外，基因工程还可以用于基因治疗，即通过将正常基因导入患者体内，修复或替代异常基因，达到治疗疾病的目的。
在农业领域，基因工程可以用于改良农作物的性状，提高农作物的产量和抗病能力。
例如，转基因作物可以通过导入抗虫基因或抗草甘膦基因，提高作物对虫害和除草剂的抵抗能力，减少农药的使用，降低环境污染。
在工业领域，基因工程可以用于生物制药和生物能源的生产。
通过基因工程技术，可以将目标基因导入微生物或植物细胞中，使其产生特定的蛋白或化合物，用于制药或生产生物能源。
二、转基因技术的定义与应用领域转基因技术是基因工程的一种重要手段，它是指将外源基因导入目标生物体中，使其具有新的性状或功能。
转基因技术主要包括基因的克隆、基因的导入和基因的表达等步骤。
转基因技术的应用领域也非常广泛。
在农业领域，转基因技术可以用于改良农作物的性状，提高农作物的产量和抗病能力。
例如，转基因水稻可以通过导入抗虫基因或抗病基因，提高水稻对虫害和病害的抵抗能力，增加产量和质量。
在医学领域，转基因技术可以用于生产重组蛋白和制备基因药物。
例如，通过转基因技术可以大量生产重组人胰岛素，用于治疗糖尿病。
此外，转基因技术还可以用于基因治疗和基因诊断，为疾病的治疗和预防提供新的手段。
在环境保护领域，转基因技术可以用于生物修复和生物控制。
基因工程制胰岛素(生工版)
④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
⑤ 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg poly（A+）RNA， 约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
cDNA 末端存在较长 的 poly（A）而影响 cDNA 测序。（原因：oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3‘ 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另 一端，有时这种全合成难以达到）
向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐热的 DNA聚合酶、PCR缓冲液（ 500mm01／L KCl；100mmol／L Tris一HCl(pH8.4)， 150mmol／L MgCl2，lmg／m1明胶）、 5mmo1／L dNTP贮备液，然后加热至93℃ 左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备
一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取
2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
2021/8/26
12
一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成， 可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活 性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、 β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂， 在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。 提 取 RNA 时 ， 首 先 用 液 氮 研 磨 材 料 ， 匀 浆 ， 加 入 TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加 入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有 RNA 的 水 相 ， 通 过 异 丙 醇 沉 淀 ， 可 获 得 比 较 纯 的 总 RNA，用于下一步mRNA的纯化。
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有关转基因的争议
“崔方之争”
科学之争还是利益之争？
VS
人胰岛素原表达法
将人胰岛素原逆转录DNA（cDNA）编码序列克隆在β-半乳糖苷酶基因的 下游，胰岛素原能形成天然的空间构象，为3对二硫键的正确配对提供了良好 的条件，使得体外折叠率高达80％以上。
AB链同时表达法
将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β—半 乳糖苷酶基因的下游。采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体 外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。
参考文献
酵母表达基因工程产物不均一性分析及其对策 王洪海，高卜渝 - 《中国科学:化学》 - 1994 - 被引量: 42 毕赤酵母高效电转化方法的探讨 张艳，杨清武，吕凤林 - 《中国修复重建外科杂志》 - 2002 - 被引量: 15 胰岛素原的基础和临床研究 骆天红 - 《国际内分泌代谢杂志》 - 1995 - 被引量: 15 人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达 房德兴，王永山 - 《中国生物化学与分子生物学报》 - 1998 - 被引量: 12 单链胰岛素前体在酵母中的分泌表达及其转变成人胰岛素 朱尚权，徐明华，许英镐，... - 《中国科学:生命科学》 - 1997 - 被引量: 10 人胰岛素原类似物(BKRA)基因三联体的构建与表达 房德兴，周宗安，翟春生，... - 《药物生物技术》 - 1999 - 被引量: 10 重组单链胰岛素的连接肽与其生物功能的关系 黄一丁，梁镇和，冯佑民 - 《中国科学:》 - 2001 - 被引量: 7
胰岛素结构
胰岛素含有三对二硫键， 其中两对二硫键在A链和 B链之间形成，另一对二 硫键在A链上。
合成方法
长期以来，人们已开发了多种大肠杆菌工程菌，但具有代表性和实用型的构 建方案主要有以下三种。
AB链分别表达法
两种工程菌分别合成β-半乳糖苷酶—人胰岛素A链、β-半乳糖苷酶—人胰 岛素B链两种融合蛋白。以2：1的分子比混合后进行体外化学折叠。
转基因 技术生产 胰岛素主讲Βιβλιοθήκη ： 组员：胰岛素和诺贝尔奖
1921年，加拿大医生班廷(Banting)和他的助手从狗的胰腺中 提取胰岛素。1922年第一次使用从牛胰腺中提取出来的胰岛素并 应用于治疗糖尿病， 1923年，班廷被授予诺贝尔生理学或医学奖， 从发现到获奖，时间不到两年，创造了诺奖史上“前无古人、后 无来者”的最短记录。
第三代胰岛素
国际市场供不应求
虽然转基因技术的长期、广泛使用已经使胰岛素的价格降得非常 低，但是由于患者需要每天注射，所以需求量非常大，仍旧有供不应 求的趋势。中国的一位普通糖尿病患者，一个月使用胰岛素需要花费 几百元。 全球已确诊的糖尿病人总数有3.2亿人，按比例推算，国际市场胰 岛素原料药年需求量约在120～130吨。但实际上，全球胰岛素总产量 只有40吨左右，可见这一市场的增长空间十分巨大。
英国生物化学家桑格 在1955年将胰岛素的氨 基酸序列完整地定序出 来，获得了1958年的诺 贝尔化学奖。
中国在1965年完成了结晶牛胰岛素的人工合成。
研究目的及意义
中国目前糖尿病患者数达1.14亿，全球的1/3。糖尿病的病因是胰岛素分泌 缺陷或其生物作用受损，所以最常用的治疗方法就是以注射胰岛素的方式 补充人体内胰岛素。 一开始胰岛素都是从狗、猪、牛等家畜的胰腺中提取而得，但是，每吨动 物胰腺中能提取的胰岛素不到5克，产量太低。 人工合成的胰岛素略微缓解全世界紧迫的需求，但是价格依然高昂，普通 人无力承担。 如何批量、廉价的生产胰岛素？办法就是“转基因”。 将人类胰岛素基因导入细菌（或真菌）中，如大肠杆菌或酵母菌，然后大 量繁殖细菌，收集细菌所分泌的“人胰岛素”。 由于细菌的繁殖呈指数级增长，一个转基因细菌在短短几小时后就能产生 上百万的后代，这意味着人们能够以很低的成本获得几乎无限量的人胰岛 素。 通过该项技术全球大多数糖尿病人才得到了很好的胰岛素治疗。
最新研究成果
速效胰岛素：新型超短效胰岛素，吸收和起效时间更 快，患者不再受到“提前30分钟”的制约，使用胰岛 素更加灵活方便，大大减少了漏用或重复用药的潜在 风险。 长效胰岛素：就是通过对人胰岛素的加工和修饰，使 其稳定、缓慢发挥作用，从而实现“打一针，管一天” 的治疗效果。并且和既往的精蛋白结合胰岛素相比， 具有作用时间更长、疗效更稳定的优点。
发展前景
为了进一步提高胰岛素产量，降低胰岛素价格，现在将人的胰 岛素基因转入植物中的技术正在被开发。加拿大SembioSys生物工程 公司利用北美洲普遍栽培的高产油料作物——红花作为转基因植物 “平台”，成功生产出“红花子来源人胰岛素”（代号SBS－1000）， 其药代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表述胰岛素 基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。理论上，每公顷红花田可生 产出1公斤人胰岛素原料药。 受到SembioSys公司的鼓舞，加拿大渥太华大学生物技术研究中心 的科研人员也利用另两种高产作物——烟草和水稻植株生产出了一种 名为“胰岛素样生长因子”（ILGF）的新型降血糖药物。据称，ILGF 的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。如果ILGF能通过临床试验并成 功上市，或将成为前景可期的国际医药市场畅销产品。