基因工程制胰岛素(生工版)
利用生物工程法制备重组胰岛素
串联BKRA基因的构建
• 为进行，合成了彼此互补的两个片段：
• 然F后7：将CTG磷GA酸G A化AC的TAFC 7TG与T A等AC摩CG尔T C的GC F正8向退链 火，中间 F8：AAT TGC GAC GGT TAC AGT AGT TCT CCA G 反向链
5’ -CTG GAG AAC TAC TGT AAC CGT CGC-
GTC ACA
TGC终A止CC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT
人胰岛素原类似物BKRA基因的克隆
• 分别以EcoRⅠ- HindⅢ双酶切pUC18 DNA和上述构
建的BKRA基因片段（182bp），将载体DNA与BKRA 片段（171bp）连接，获得重组质粒pUCⅠ。分别经 EcoRⅠ-HindⅢ双酶切和PvuⅡ不完全酶切鉴定，均产 生了与 其大小的DNA片段。
GGC TTC
小C肽
GAG CAT CTT CGA GAC ATG GAC CAA ACG CCA CTT GCA
CCG AAG
Lys Arg
PvuII F7F8接头
TTT TAC ACT CCG AAA ACT AAG CGC GGT ATC GTT GAA
CAG TGT
AAA ATG TGA GE*GC TTT TGA TTC GCG CCA TAG CAA CTT
串联BKRA基因的构建
• 为了正确连接两个BKRA基因，在此设计了一个
连接头接在前一个BKRA基因的末端，并构建了 一个能与下一个BKRA基因5’端EcoRI粘端互补 的序列。
• 然而由于接头是在PvuII平末端与前一个BKRA
基因连接的，因此会切掉部分胰岛素A链基因， 所以接头要补上相应的部分。
胰岛素工艺流程
胰岛素工艺流程胰岛素是一种重要的激素，它在调节血糖水平方面发挥着关键作用。
胰岛素的生产需要经过一系列复杂的工艺流程，包括基因工程、发酵、纯化和制剂等环节。
下面将详细介绍胰岛素的工艺流程。
1. 基因工程胰岛素的生产通常采用大肠杆菌或酵母等微生物作为宿主。
首先需要将人类胰岛素基因导入到宿主细胞中，这一步需要通过基因工程技术完成。
将人类胰岛素基因插入到宿主细胞的染色体中，使其成为宿主细胞的一部分。
2. 发酵接下来是发酵过程，将经过基因工程改造的宿主细胞培养在发酵罐中，提供适宜的温度、pH值和营养物质，促使宿主细胞表达胰岛素基因并合成胰岛素蛋白。
发酵过程通常需要持续几天到几周不等，直到胰岛素蛋白达到一定的浓度。
3. 纯化发酵结束后，需要对发酵液进行纯化，将其中的胰岛素蛋白提取出来。
纯化过程包括离心、过滤、层析等步骤，通过这些步骤可以将胰岛素蛋白从其他蛋白质、核酸和杂质中分离出来，得到相对纯净的胰岛素蛋白。
4. 制剂经过纯化的胰岛素蛋白需要进行制剂，以便于患者使用。
制剂的过程包括溶解、过滤、浓缩、消毒和灌装等步骤，最终得到胰岛素注射液或胰岛素粉剂，可以供患者使用。
5. 质控在整个生产过程中，需要对胰岛素产品进行严格的质量控制。
包括对宿主细胞、发酵液、纯化产物和制剂进行检测，确保胰岛素产品的纯度、活性和安全性符合要求。
总结胰岛素的生产工艺流程涉及基因工程、发酵、纯化和制剂等多个环节，每个环节都需要严格控制，确保胰岛素产品的质量和安全性。
随着生物技术的发展，胰岛素的生产工艺也在不断优化，未来胰岛素产品的质量和效果会得到进一步提升。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料09级制药工程（1）班叶溢民090219011基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
基因工程胰岛素生产流程
基因工程胰岛素生产流程首先呢，得有合适的基因来源。
一般来说，我们会从人类细胞里找到产生胰岛素的基因。
这一步很关键哦！要是基因找错了，后面可就全乱套了。
不过呢，这个找基因的过程也不是那么死板的，不同的实验室或者公司可能会有自己的小窍门。
我觉得只要能准确找到那个产生胰岛素的基因就好啦。
接下来就是把这个基因提取出来。
这就像是从一大把钥匙里挑出一把特定的钥匙一样。
怎么提取呢？这就涉及到一些生物技术手段啦，但咱们不用纠结太多技术细节。
简单说，就是利用一些化学试剂和特殊的仪器设备把基因从细胞里弄出来。
根据经验，这个过程要特别小心，动作稍微大一点可能就会破坏基因的完整性，那可就糟糕了！然后呢，要把提取出来的胰岛素基因放到一个载体里。
这个载体就像一个小卡车，可以把基因运到我们想要的地方。
载体的选择也有不少呢，像质粒就是比较常用的一种。
不过你也可以根据实际情况选择其他合适的载体哦。
这一步呀，我觉得就像是给基因找个舒适的“座驾”，好让它顺利到达目的地。
再接下来就是把带有胰岛素基因的载体送到宿主细胞里。
宿主细胞就像是一个小工厂，基因进去之后就可以在里面开始工作啦。
这个宿主细胞可以是细菌，比如大肠杆菌就经常被用到。
为什么选择大肠杆菌呢？因为它繁殖快呀，就像一个勤劳的小工人，能快速大量地生产我们想要的东西。
当然啦，选择大肠杆菌也有一些小麻烦，不过只要处理得当就没问题啦。
在宿主细胞里，胰岛素基因就开始指挥细胞合成胰岛素啦。
这个过程有点像在工厂里按照设计图纸生产产品一样。
但是呢，这个环节可能不会那么顺利，有时候细胞可能会不听话，生产出一些不合格的产品。
这时候该怎么办呢？这就需要我们不断地监测和调整啦。
小提示：可别小看这个监测过程哦！等胰岛素在宿主细胞里合成得差不多了，就要把胰岛素从细胞里分离出来。
这就像从工厂的产品堆里把我们想要的产品挑出来一样。
这个过程也不是那么容易的，不过只要有合适的方法就可以做到。
我觉得这一步可以更灵活一点，根据自己现有的设备和技术来选择合适的分离方法就好啦。
基因工程生产人胰岛素的技术路线
基因工程生产人胰岛素的技术路线人胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。
传统的人胰岛素生产方法是从猪胰腺中提取，但存在感染风险和胰岛素结构与人体有差异等问题。
为了解决这些问题，科学家们利用基因工程将人胰岛素基因克隆到大肠杆菌等微生物中，通过基因表达、突变、筛选、纯化等步骤，生产出高质量的人胰岛素。
技术路线如下：1. 克隆人胰岛素基因：从人胰岛细胞中分离出mRNA，利用反转录酶将其转录成cDNA。
通过PCR扩增，将人胰岛素A、B链合成成一个完整的人胰岛素基因。
在该过程中，要注意选择合适的启动子、终止子、信使RNA起始和终止密码子等。
将该基因插入到载体中，如大肠杆菌质粒pBR322中的限制性内切酶位点，使其能够在大肠杆菌中表达。
2. 基因表达：将含有人胰岛素基因的重组质粒经过转化技术，导入到大肠杆菌中，利用细胞自身的代谢活性，让其经过转录、翻译等步骤，表达出人胰岛素前体蛋白(Proinsulin)。
Proinsulin蛋白由A、B两个多肽链组成。
其中A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。
A链和B链由两个酯键连接在一起，形成Proinsulin。
Proinsulin在细胞内被剪切成人胰岛素A、B链和C肽。
其中C肽并无生理作用，被细胞内酶降解分解。
3. 突变筛选：由于大肠杆菌系统中表达的人胰岛素前体蛋白形成的Proinsulin无法自行成熟转化为人胰岛素，因此必须人为帮助B链成熟多肽链的脱落。
突变技术可以改变Proinsulin分子内酶解的敏感性和特异性，使B链多肽链和C肽之间的酯键能够被限制酶特异性水解，得到纯度较高的人胰岛素。
4. 纯化：通过离心、层析、过滤等技术，将发酵液中的人胰岛素纯化提取。
常用的纯化方法包括离心、酸性沉淀、离子交换层析、有机溶剂沉淀、逆流层析、凝胶过滤等。
整个生产过程包括基因克隆、表达、突变、筛选、纯化，一般需要经过6-7天的培养过程。
通过基因工程生产人胰岛素，不仅能够解决传统人胰岛素来源的问题，而且能够生产高质量、高效率的人胰岛素。
基因工程获取胰岛素的主要步骤
基因工程获取胰岛素的主要步骤胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的蛋白质激素，对调节血糖水平起着重要作用。
胰岛素的分子结构由两个多肽链组成，分别为A链和B链，通过二硫键连接在一起。
A链含有21个氨基酸残基，B链含有30个氨基酸残基。
胰岛素的结构决定了它的生物活性和稳定性。
基因工程是一种利用DNA技术对目标基因进行修饰和重组的方法，可以大规模生产胰岛素。
以下是基因工程获取胰岛素的主要步骤：1. 基因克隆：首先需要从人体或其他来源中获得胰岛素基因的DNA 序列，然后使用PCR技术扩增所需基因片段。
扩增后的基因片段将被插入到一个载体中，如质粒或病毒。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。
2. 转化宿主细胞：将质粒或病毒载体导入宿主细胞中，使其拥有胰岛素基因。
最常用的宿主细胞是大肠杆菌，因为大肠杆菌具有较高的转化效率和易于培养的特点。
3. 表达胰岛素基因：在宿主细胞中，胰岛素基因将被转录成mRNA，随后翻译成胰岛素蛋白。
为了提高胰岛素的表达水平，可以使用启动子和增强子等调控元件来增强基因的表达。
4. 纯化与结构修饰：经过表达后，胰岛素蛋白可以通过离心、层析和过滤等手段进行纯化。
纯化后的胰岛素蛋白需要进行结构修饰，如对A链和B链进行二硫键的形成，以及其他可能的糖基化修饰。
5. 活性检测与质量控制：获取的胰岛素蛋白需要进行活性检测，以确保其具有正常的生物活性。
同时，还需要进行质量控制，如测定蛋白的纯度、含量和杂质的检测。
6. 大规模生产与制剂开发：经过活性检测和质量控制后，胰岛素蛋白可以进行大规模生产。
生产过程中需要考虑生产工艺、设备的选择和合理的工艺优化。
同时，还需要开发适合临床使用的胰岛素制剂，如注射剂、胰岛素泵等。
通过基因工程获取胰岛素的方法使得胰岛素的大规模生产成为可能，不仅能够满足临床需求，还能够提高胰岛素的纯度和质量稳定性。
基因工程技术的不断发展也使得胰岛素的生产成本逐渐降低，更加便于患者的使用。
通过基因工程体外制备胰岛素的关键步骤
通过基因工程体外制备胰岛素的关键步骤基因工程胰岛素的奇幻之旅嘿，朋友们，今天咱们来聊聊那个让糖尿病人头疼不已的问题——如何通过基因工程体外制备胰岛素。
这可不是闹着玩的，得用点高科技手段才能搞定。
别急，让我给你娓娓道来。
首先得提提这个“基因”大家伙。
它可是个神奇的存在，能决定我们的身体怎么工作，就像个超级工程师，设计出各种零件和系统。
而胰岛素呢，就像是身体里的润滑油，帮助细胞们好好地干活儿。
但是啊，有些小伙伴因为身体里少了点什么，就像机器缺了润滑油一样，没法正常运转了。
怎么办呢？别担心，科学家们发现了一个好办法——通过基因工程来“补油”。
他们就像是给机器换上新的零件，让胰岛素的生产变得像变魔术一样神奇。
想象一下，如果有个超级工厂，专门生产胰岛素，而且还能根据每个人的需求来调整产量，那该多好啊！没错，这就是基因工程胰岛素的制作过程。
科学家们先是从健康的牛身上提取胰岛素基因，然后把它们“克隆”到细菌或者酵母菌里。
这些小家伙就开始忙碌起来，不停地制造胰岛素。
接下来，科学家们还得对制造出来的胰岛素进行一番“改造”，让它变得更适合人体使用。
这个过程就像是给机器装上新零件，让它跑得更快、更稳。
经过一系列复杂的测试和调整，最终得到的胰岛素就像是一颗颗精心打磨的宝石，既安全又有效。
现在，让我们把目光投向那些糖尿病患者吧。
他们曾经因为这个病痛而苦恼不已，但现在有了基因工程胰岛素，生活可以重新回到正轨上了。
想想看，那些曾经因为胰岛素不足而饱受折磨的人，现在终于可以像正常人一样生活了，这是多么令人欣慰的事情啊！当然啦，虽然基因工程胰岛素的出现给糖尿病治疗带来了希望，但我们也不能掉以轻心。
毕竟，任何新技术都需要在实践中不断完善和发展。
所以，我们还需要继续关注这项技术的研究进展，为糖尿病患者带来更多更好的治疗方案。
基因工程胰岛素的出现就像是一场科技与自然的完美结合，让我们看到了未来医疗的美好前景。
让我们一起期待这一天的到来，为更多的糖尿病患者带去希望和温暖吧！。
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程 （1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静臵5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组 织均可）臵1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室 温静臵5min。 （2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静臵2min。 （3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。 （4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静臵 10min。 （5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。 （6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min， 弃上清液。 （7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。
2015/9/30 14
一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程图
2015/9/30
15
一、获取外源目的基因片段
2．2 mRNA的纯化
该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷 酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时， 在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结 合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。 经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的 mRNA。
2
基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
化学合成 A链和B链
的编码序
列
2015/9/30
3
基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
表达产
物的后
期处理 路线：
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4
基因工程制胰岛素三种方法
二、人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
2015/9/30
5
基因工程制胰岛素三种方法
2015/9/30
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一、获取外源目的基因片段
3．逆转录mRNA,得cDNA第一链
mRNA在反转录酶的作用下由引物引导合成cDNA。 加入高浓度的 Oligo（dT）引物， ，Oligo（dT）引 物与 mRNA 的 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转 录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 cDNA 末端存在较长 的 poly（A）而影响 cDNA 测序。（原因：oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3‘ 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一 端，有时这种全合成难以达到）
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
（2）操作步骤：
① 将0.5-1.0g寡聚（dT）纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。 ② 用DEPC处理的1ml 注射器或适当的细管，将寡聚（dT）纤维素装柱0.5-1ml，用3 倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。 ③ 使用1*上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 ④ 将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2*上样 缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1*上样 缓冲液洗柱，继续收集流出液。 ⑤ 将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。 ⑥ 用5-10倍柱床体积的1*上样缓冲液洗柱，每管1ml分步收集，OD260测定RNA含量。 前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无polyA尾的RNA。后部分收集管 中流出液的OD260值很低或无吸收。 ⑦ 用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly（A+）RNA，分步收集，每部分为1/3-1/2柱 体积。 ⑧ OD260测定poly（A+）RNA分布，合并含poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放臵30min。 ⑨ 4℃离心，10000g*15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。4℃离心， 10000g*5min，弃上清，室温晾干。 ⑩ 用适量的DEPCH2O溶解RNA。
二、人胰岛素原表达法
表达产物的后 期处理路线：
2015/9/30
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基因工程制胰岛素三种方法
三、A链和B链同时表达法
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基因工程制胰岛素三种方法
三种方法比较：
方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二 硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成 本高。
方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正 确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
2015/9/30
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一、获取外源目的基因片段
4．得双链DNA
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
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一、获取外源目的基因片段
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
mRNA－cDNA 杂合双链中的 mRNA 链在 RNA 酶 H 作用下先形成很多切 口， mRNA 链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌 DNA 聚 合酶 Ⅰ 提供了合成第二链的引物。大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 以第一 链 cDNA 为模板合成一段段互补的 cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而 在 DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即 cDNA 的第二链。遗留在 5'末端的一段很小的 mRNA 也被大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5'3' 核 酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3'-端部分 序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5' 核酸外切酶的活性可 将暴露出的第一链 cDNA 的 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平 端 优点: a)合成cDNA的效率高 b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化 c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
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一、获取外源目的基因片段
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
2015/9/30
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一、获取外源目的基因片段
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
4.2.1模板DNA的变性 向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐热的DNA 聚合酶、PCR缓冲液（ 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4)，150mmol／L MgCl2，lmg／m1明胶）、5mmo1／L dNTP贮备 液，然后加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备
方法三： 需体外折叠。
2015/9/30 8
基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
2015/9/30 9
一、获取外源目的基因片段
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一、获取外源目的基因片段
2．3 mRNA的保存
用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成 或保存在70%乙醇中并于-70℃下贮存。
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一、获取外源目的基因片段
胰岛素基因mRNA序列
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一、获取外源目的基因片段
胰岛素基因mRNA序列
NCBI中搜索得
用基因工程方法 获得胰岛素
第四组
2015/9/30 1
2015/9/30
胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白 质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖 的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治 疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因 子具有高度生物活性，分子量很大，立 体结构异常复杂，体外难以人工合成。 所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪 体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰 岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪 胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期 服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治 疗。
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一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取 2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
2015/9/30 12
一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可 以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释 放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有 效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8 －羟基喹啉、异硫氰酸胍、β- 巯 基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。 TRIzol 是从细胞和组织中提取总 RNA的即用型试剂，在样品裂 解或匀浆过程中， TRIzol 能保持 RNA 完整性。提取 RNA 时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入 TRIzol 试剂， 进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提， 离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过 异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA 的纯化。
2015/9/30 18
一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
（3）注意事项
① 整个实验过程必须防止Rnase的污染。 ② 步骤④中将RNA溶液臵65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有 两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA poly（A+）尾处的二 级结构，使poly（A+）尾充分暴露，从而提高poly（A+）RNA的回收率； 另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所 以此步骤不能省略。 ③ 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动， 若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。 ④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。 ⑤ 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg poly（A+）RNA， 约相当于上柱总RNA量的1%-2%。