单克隆抗体制备过程中的两次筛选
单克隆抗体制备过程中的两次筛选
动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。
在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。
第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。
第一次筛选：
细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选：
在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。
因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。
专题2 2.2 动物细胞融合和单克隆抗体(练习作业)参考答案【学习后使用】
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体【作业】一、选择题1.关于动物细胞融合的说法，不正确的是()A．动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程B．动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞C．常用的诱导动物细胞融合的因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激、紫外线照射D．细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能解题分析A项为动物细胞融合的含义；B项是融合后细胞的特点；C项中紫外线照射常用于人工诱变，可诱发基因突变，而不是诱导细胞融合的因素，常用的诱导动物细胞融合的物理因素是离心、振动和电激；D项为动物细胞融合的意义。
答案 C2.动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是()A．诱导融合的方法完全相同B．所用的技术手段完全相同C．所采用的原理完全相同D．都能形成杂种细胞解题分析两种细胞工程所用的技术手段不完全相同，植物体细胞杂交时要先去除细胞壁后诱导原生质体融合，而动物细胞融合时，要先使细胞分散后再诱导细胞融合，B错误；诱导的方法，除动物细胞的融合常用灭活的病毒作诱导剂外，其他的二者基本相同，A错误；二者采用的原理不同，动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性，最终形成的是杂交细胞，植物体细胞杂交还用到细胞的全能性，最终形成杂种植株，C错误。
答案 D3.动物细胞融合属于动物细胞工程的技术手段之一，下列有关动物细胞融合的叙述正确的是()A．动物细胞融合产生的细胞称为重组细胞B．融合后形成的细胞为单核或多核细胞C．常用的诱导融合的生物诱导剂是聚乙二醇、灭活的病毒等D．也称细胞杂交，可由两个或多个动物细胞结合成一个细胞答案 D解析动物细胞融合产生的细胞称为杂交细胞，核移植产生的细胞称为重组细胞，A错误；融合后形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，B错误；诱导动物细胞融合的生物诱导剂是灭活的病毒，聚乙二醇属于化学诱导剂，C错误；动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，D正确。
单克隆抗体的第二次筛选原理
单克隆抗体的第二次筛选原理今天来聊聊单克隆抗体的第二次筛选原理，这可真是个挺有趣的事儿呢。
我先给你讲个生活中的小现象吧，就好比我们从一群混杂着各种不同类型小珠子的盒子里，挑出某一种特定颜色和形状的珠子。
单克隆抗体制备的过程有点类似，不过这可比挑珠子复杂太多啦。
在单克隆抗体产生的过程中，我们先由骨髓瘤细胞和经过免疫的B淋巴细胞融合形成杂交瘤细胞。
这个时候就像是一个大杂烩，里面融合的细胞多种多样，有正常的B淋巴细胞之间的融合、骨髓瘤细胞之间的融合，还有没用的没融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞呢。
这就像是混在一起的不同颜色、大小、材质的多种珠子一样。
于是就需要进行筛选啦。
第一次筛选是用特定的培养基，把没融合的骨髓瘤细胞和融合后细胞中那些不正常的淘汰掉，其实就是选出我们想要的包含杂交瘤细胞这个大概范围的“珠子”。
这就要说到第二次筛选了。
老实说，我一开始也不明白为什么已经筛选过一次了还需要第二次筛选呢？原因是这样的，在第一次筛选留下的杂交瘤细胞中，它们产生的抗体不一定都能完全符合我们的要求：不是所有的杂交瘤细胞都产生了那种我们想要的特异性很强的单克隆抗体。
就好比在一堆形状相近的珠子里，有的只是稍微有点相似，但不是完全一样。
打个比方吧，假如把我们要的能产生特定作用单克隆抗体的杂交瘤细胞想象成是出色的歌手，其他的杂交瘤细胞产生的抗体可能就像是那些只能偶尔唱出一两个高音或者根本走调的歌手。
第二次筛选就是要把那些真正出色的“歌手”找出来，也就是产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
这个筛选方法呢，一般是通过克隆化培养和专一抗体检测阳性，找到那个能产生我们所需特异性抗体的单个杂交瘤细胞。
说到这里，你可能会问，那这个在实际生活中有啥用呢？作用可大啦。
在医学上治疗癌症方面，像赫赛汀是一种单克隆抗体药物。
它就是针对癌细胞表面的特定蛋白这种“坏蛋分子”产生作用的，就像精确制导的导弹一样，只打击癌细胞，而不会误伤正常细胞，这都得益于单克隆抗体特异性很强的这个特性，所以二次筛选准确选出能产生这种特异性抗体的细胞很关键。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选制备单克隆抗体的过程一般包括以下步骤：免疫原的制备、免疫小鼠、脾细胞融合、杂交瘤筛选和克隆、筛选单克隆杂交瘤、扩增和纯化单克隆抗体。
首先，免疫原的制备是制备单克隆抗体过程的第一步。
免疫原可以是纯化的蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
免疫原的选择和制备需要根据实验的目的和需求进行设计。
第二步是免疫小鼠。
免疫小鼠是制备单克隆抗体的常用动物模型。
通常选择BALB/c小鼠作为实验动物，并使用免疫佐剂增强免疫效果。
小鼠需要进行免疫，例如通过皮下注射、肌肉注射等途径将制备好的免疫原注射到小鼠体内。
第三步是脾细胞融合。
在获得免疫反应满意的小鼠后，需要从其脾脏中获得淋巴细胞。
将脾细胞与合适的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合的方法包括传统的体外融合和新型的凭借细胞融合特性的电融合等。
第四步是杂交瘤筛选和克隆。
将融合得到的细胞悬浮液进行稀释，使得每个孔中只存在一个细胞。
然后需要在含有细胞导入剂的选择培养基中培养杂交瘤细胞。
导入剂可以使得杂交瘤细胞在含有肿瘤抗原的培养基中进行生长，而非杂交瘤细胞则会死亡或生长缓慢。
通过这样的选择，可以筛选出产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
第五步是筛选单克隆杂交瘤。
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，筛选出产生特定抗原结合特异性的单克隆杂交瘤细胞。
这一步骤可以帮助确定那些产生目标抗原结合特异性抗体的杂交瘤细胞。
经过初步筛选和单克隆筛选之后，通常会得到一定量的单克隆抗体，然而这些抗体还需要经过进一步的扩增和纯化。
扩增单克隆抗体的过程涉及到培养大量的单克隆杂交瘤细胞，并进行培养和收集细胞上清液。
最后一步是纯化单克隆抗体。
通过蛋白质A/G亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等技术手段，将目标单克隆抗体从细胞上清液中纯化出来。
在整个制备单克隆抗体的过程中，经过两次筛选是确保获得特异性抗原结合能力的单克隆杂交瘤细胞的重要步骤。
只有通过这样的筛选过程，才能获得具有较高亲和力和特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法:细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A)和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径"），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”.另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可.因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S 途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡.对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径",且“D 途径"又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT 培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
白细胞介素6试题
白细胞介素6试题？
答：以下是一道白细胞介素6相关试题：
白介素6（IL-6）是引发新冠肺炎患者炎症风暴中的关键炎症因子，能使机体出现高烧、呼吸衰竭等症状。
托珠单抗是一种阻断白细胞介素-6（IL-6）受体的单克隆抗体，它能改善重症COVID-19患者的临床症状，是救治新冠肺炎重症患者的有效方法。
请回答下列问题：
1.托珠单抗制备过程中涉及两次筛选，第一次是利用特定的选择培养基排除未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞，只留下杂交瘤细胞；第二次是通过_______获得足够数量能产生托珠单抗的杂交瘤细胞。
2.研究发现，托珠单抗用于治疗新冠肺炎患者后，患者的体温恢复正常，该调节过程的中枢位于_______。
3.研究发现，在托珠单抗治疗后，以CD8+T细胞为代表的细胞免疫应答和以B细胞为代表的_______免疫应答均有一定程度提高，减弱了炎症细胞因子风暴可能对机体带来的损伤，同时可以帮助机体维持高水平的抗病毒免疫应答，从而有效治疗疾病。
答案：
1.抗体检测
2.下丘脑
3.体液。
解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选
解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选在单克隆抗体制备中两次提到筛选问题，那么两次筛选的目的和方法到底是什么。
关键词选择性培养基多孔培养板单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那么到底是如何筛选的呢？现总结如下：第一次筛选: 首先在（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚，（一）可能的情况有：1 （效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合2 (效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）3 骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）4 单个骨髓瘤细胞5 单个（效应）B淋巴细胞（二）筛选的目的————获得杂交瘤细胞（三）筛选的方法用选择性培养基来完成，即HAT培养基。
含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。
主要途径阻断后，依靠应急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成不能发生。
用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。
B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。
因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。
所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。
所以产生抗体是不纯的。
如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。
所以就有了第二次筛选。
第二次筛选要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。
(一) 筛选的目的筛选只针对某一种特定的抗原决定簇产生抗体的杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体（二）筛选的方法1、分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养2、检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体（即教材插图中提到的选出能产生特定抗体的细胞群）所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。
第41讲 动物细胞工程(练习)(解析版)
第41讲动物细胞工程1．（2023·全国）克隆猴“中中”和“华华”登上学术期刊《细胞》封面，表明我国的克隆技术再次走在世界前列。
“中中”和“华华”的诞生成功证明了（）A．动物细胞的全能性B．动物细胞的再生能力C．动物细胞核的全能性D．动物细胞的分化能力【答案】C【分析】全能性是指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体（或分化为各种细胞）的潜力。
全能性原因：已分化的细胞都含有该物种所特有的全套的遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。
【详解】高度分化的动物细胞，从整个细胞来说，它的全能性受到限制，但它的细胞核仍保持着全能性，因为细胞核内含有保持物种遗传性状所需要的全套遗传物质。
“中中”和“华华”就是用乳腺细胞的细胞核与去核卵细胞重组形成的一个细胞发育而成的，这证明动物细胞的细胞核具有全能性。
故选C。
2．（2023秋·湖北·高三荆州中学校联考阶段练习）小鼠作为一种与人类基因组序列相似度较高的哺乳动物，常用于人类某些疾病的研究。
小鼠胚胎干细胞的培养过程如图所示，下列叙述错误的是（）A．胚胎干细胞具有分化为成年动物体内的任何一种类型细胞的潜能B．体外培养胚胎干细胞需提供的气体环境是95%的CO2和5%的空气C．图中胚胎干细胞分化后的组织移入小鼠替代病变器官属于治疗性克隆D．图中重组细胞重编程、分裂、分化最终产生的小鼠与患病鼠性状相似【答案】B【分析】胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。
特点：具有胚胎细胞的特性，体积较小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物任何一种组织细胞。
另一方面，在体外培养条件下，ES细胞可不断增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可以进行某些遗传改造。
【详解】A、胚胎干细胞有全能性，具有分化为成年动物体内的任何一种类型细胞的潜能，A正确；B、体外培养胚胎干细胞需提供的气体环境是95%的空气和5%的CO2，B错误；C、图中胚胎干细胞分化后的组织移入小鼠替代病变器官属于治疗性克隆，C正确；D、图中重组细胞重编程、分裂、分化最终产生的小鼠与患病鼠性状相似，因为细胞核来自患病鼠，D正确。
(整理)单克隆抗体制备过程中经过两次筛选.
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
单克隆抗体的制备操作至少要进行几次细胞筛选（）A.1次B.2次C.3次D.4次题目和参考答案
单克隆抗体的制备操作⾄少要进⾏⼏次细胞筛选（ ）
A、1次
B、2次
C、3次
D、4次
考点：单克隆抗体的制备过程
专题：
分析：单克隆抗体的制备过程的细节：
（1）⼆次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及⾃⾝融合的细胞）；
②筛选出能够产⽣特异性抗体的细胞群．
（2）细胞来源：B淋巴细胞：能产⽣特异性抗体，在体外不能⽆限繁殖；
⾻髓瘤细胞：不产⽣专⼀性抗体，体外能⽆限繁殖．
（3）杂交瘤细胞的特点：既能⼤量增殖，⼜能产⽣特异性抗体．
（4）提取单克隆抗体：从培养液或⼩⿏腹⽔中提取．
解答：解：单克隆抗体制备过程的两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及⾃⾝融合的细胞）；②筛选出能够产⽣特异性抗体的细胞群．
故选：B．
点评：本题考查单克隆抗体的制备过程，意在考查考⽣的识记能⼒和理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能⼒；能运⽤所学知识，对⽣物学问题作出准确的判断，难度不⼤．。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选集团标准化小组：[VVOPPT-JOPP28-JPPTL98-LOPPNN]单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B 细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。