过滤膜法测粪大肠菌群数-国标方法
水质粪大肠菌群的测定（多管发酵法和滤膜法）HJ347-2017.pdf
水质 粪大肠菌群的测定粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。
在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。
用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。
粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。
第一篇 多管发酵法1 适用范围本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2原理多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
3 培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
3.1单倍乳糖蛋白胨培养液：成分：蛋白胨10g牛肉浸膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
3.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。
3.3 EC培养液：成分：胰胨20g乳糖5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4）4g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
滤膜法检测粪大肠菌群方法
滤膜法检测粪大肠菌群方法摘要：在水质分析中，采用粪大肠菌群滤膜法所需的仪器简单，操作简便快捷，适用于地表水、地下水等杂质较少水样。
对此实验方法易产生的问题及影响测定值的因素进行分析，提出了几个关键的问题及改进措施，以提高粪大肠菌群测定的效率及精度。
关键词：粪大肠菌群滤膜法注意事项C35 A大肠菌群是卫生防疫和环境保护监督执法的重要评价指标。
多年来大肠菌群作为卫生环境评价的指标，在传染病防治、食品卫生质量监测、污水综合排放控制评价、水资源生态环境变化等方面发挥了巨大作用。
目前国内的粪大肠菌群检测方法有多管发酵法、滤膜法、酶法、LTSE法和纸片法等。
其中，滤膜法检测粪大肠菌群，是利用微孔滤膜过滤一定量水样，将水样中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养和证实试验后，直接计数滤膜上生长的典型粪大肠菌群菌落，并计算出每升水样中含有的粪大肠菌群数。
本研究主要是针对滤膜法再实际监测工作中的可行性，利用实际水样对滤膜法与发酵法监测结果进行对比，并对滤膜法的重复性和准确性进行统计与评价。
一、概述粪大肠菌群是总大肠菌群的一个亚种，直接来自粪便，它除了耐热，在44~44.5℃的高温条件仍可生长繁殖并将色氨基酸代写成吲哚处，其他特性均与总大肠菌群相同。
总大肠菌群中的细菌除了生活在肠道中，在自然环境中的水与土壤也经常存在，但在这些自然环境中生活的大肠菌群培养的最适合温度为25℃，如在37℃培养则仍可生长，但如果将培养温度上升至44℃则不可生长，而直接来自粪便的大肠菌群，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44.5℃仍可继续生长。
因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开。
在37℃培养生长的大肠菌群，包括粪便内生长的大肠菌群成为总大肠菌群 Total colifrom，在44.5℃仍能生长的大肠菌群称为粪大肠菌群 Fecal colifrom，粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。
粪大肠菌群的测定滤膜法方法验证报告
方法验证报告项目名称：粪大肠菌群的测定方法名称：水质粪大肠菌群的测定滤膜法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2 实验室检测技术能力2.1适用范围本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的的测定。
本方法的检出限为:当接种量为100ml时，检出限为10CFU/L;当接种量为500ml时，检出限为2CFU/L。
2.2 样品保存采样后应在2h内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6h。
实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品在4℃以下冷藏并在2h内检测。
2.3检测步骤2.3.1样品过滤根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为10ml ,如接种量小于10ml时应逐级稀释。
先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。
理想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为20-60个，总菌落数不得超过200个。
当最小过滤体积为10ml 时，滤膜上菌落密度仍过大时，则应对样品进行稀释。
1：10稀释的方法为：吸取10ml样品，注入盛有90ml无菌水的三角瓶中，混匀，制成1：10稀释样品。
用灭菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜，贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水冲洗器壁2-3次。
样品过滤完成后，再抽气约5秒，关上开关。
2.3.2培养用灭菌镊子夹取滤膜移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将培养皿倒置，放入恒温培养箱内，（44.5±0.5）℃培养24h±2h。
滤膜法测定粪大肠菌群
滤膜法测定粪大肠菌群37.1.1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。
37.1.2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，经44.5℃培养后，计数典型菌落。
37.1.3 培养基与试剂37.1.3.1 MFC培养基37.1.3.1.1 成份A 胰胨 10gB 多胨 5gC 酵母浸膏 3gD 氯化钠 5gE 乳糖 12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)或混合胆盐 1.5gG 琼脂 15gH 苯胺蓝 0.2gI 蒸馏水 1000mL37.1.3.1.2 制法: 在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。
制好的培养基应存放于2～10℃，不超过96h。
本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。
37.1.3.2 EC培养基37.1.3.2.1 成份A 胰蛋白胨 20gB 乳糖 5g37.1.1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。
37.1.2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，经44.5℃培养后，计数典型菌落。
37.1.3 培养基与试剂37.1.3.1 MFC培养基37.1.3.1.1 成份A 胰胨 10gB 多胨 5gC 酵母浸膏 3gD 氯化钠 5gE 乳糖 12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)或混合胆盐 1.5gG 琼脂 15gH 苯胺蓝 0.2gI 蒸馏水 1000mL37.1.3.1.2 制法: 在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。
水质粪大肠测定方法
水质粪大肠测定方法我折腾了好久水质粪大肠的测定方法，总算找到点门道。
说实话，一开始我也是瞎摸索。
我最早尝试的时候，就像没头的苍蝇一样乱撞。
我知道传统的方法有滤膜法之类的。
就先说这个滤膜法吧，你得先采集水样，这就像是从大池塘里舀一勺水出来，不过这一勺水可得有讲究，要能代表整个池塘的情况。
采集完水样后，要把培养液准备好，这培养液就像是运动员的营养餐，是专门给粪大肠菌准备的“食物”，营养成分得合适。
然后把水样通过滤膜过滤，这个步骤就好比筛沙子，要把粪大肠菌留在滤膜上。
但是我刚开始的时候就弄错了滤膜的种类，结果根本测不出来，后来才知道要用专门用于这种测定的滤膜才行。
还有多管发酵法，这个方法开始的时候得把水样分装到好多小试管里头，就像把糖果分装到小盒子里一样。
给这些小试管里添加一些试剂，给粪大肠菌创造适合生长的环境。
我当时有一回呀，试剂的量没加准，有的加多了有的加少了，这就像做饭的时候盐放多放少了一样，结果就不准确了。
在这个过程中，温度也很关键，要给这些试管放在合适的温度下培养，就像孵小鸡一样，温度不对这小鸡可孵不出来，粪大肠菌也生长不好。
我在温度控制这块就吃过亏，当时设备有点问题，温度老是波动，导致最后的结果偏差特别大。
我又重新做了一遍，在整个过程中时刻盯着温度计，才得到了准确一点的结果。
对于这些水样里粪大肠菌的测定，要多次重复试验才能更准确。
你不能只做一次就觉得万事大吉了。
而且在每次操作之前，一定要把仪器设备都清洗干净，这就跟我们洗碗一样，如果碗没洗干净，下次吃饭肯定有问题，仪器不干净就会影响测定结果。
另外，我觉得有时候自己没什么把握的时候，多去看看那些标准的操作指南书或者向有经验的人请教请教很有必要。
虽然我在这个测定方法上还是会时不时出点小差错，但是每次出现错误后就变得更有经验，下次再做就会好很多了。
再来说说另外一种方法膜过滤- 多管发酵法。
这个方法先是膜过滤，这步的关键在于膜要是质量好又适合的。
我有一次图便宜用了个不太正规的膜，结果过滤效果不好。
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
滤膜法测定地表水中粪大肠菌群的测量不确定度评定方法
滤膜法测定地表水中粪大肠菌群的测量不确定度评定方法2北京同仁堂健康药业股份有限公司摘要：通过对《水质粪大肠菌群的测定滤膜法》（HJ347.1-2018）的不确定度分析、评定，从结论中可分析该方法的实验误差，为该方法的提高该方法的数据准确的提供依据。
同时也可为其他水中微生物指标的不确定度评定提供参考。
关键词：粪大肠菌群；不确定度评定；地表水引言：粪大肠菌群即耐热大肠菌群，并非细菌学分类名称，而是卫生学用语，它们指的不是某一种或某一属细菌，而是一类细菌，是指在44.5℃培养24h，能够发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
主要包括大肠埃希氏菌属和耐热的克雷伯菌属细菌，是生长于人和温血动物肠道中的一类肠道细菌。
它主要来自粪便，在自然界中易死亡，若检出则说明检测对象近期受到了粪便污染，水体中存在着被粪便污染的可能性，暗藏着中毒和传染病的威胁，对人群健康具有一定的危险性。
不确定度评定是表示被测量数据分散性的非负数值，是判断测定结果有效性的重要依据。
【1】通过对检测结果测量不确定度的评定，可以分析出检测过程中哪些因素需要重点关注，从而提高检测能力，确保数据准确。
本文分析滤膜法测定地表水中粪大肠菌群过程中引入不确定度的来源，比较各不确定度分量所占的比重，计算地表水中粪大肠菌群测定结果的测量不确定度，从而定量描述地表水中粪大肠菌群测定结果的测量扩展不确定度。
为类似粪大肠菌群测定结果不确定度的评定提供参考。
1材料与方法1.1试验材料地表水：采自北京市丰台区马草河；MFC培养基：北京陆桥技术股份有限公司；无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm，广东环凯微生物科技有限公司。
1.2仪器与设备BHC-1300A2型生物安全柜：苏州博莱尔净化设备有限公司；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；GHP-9050N隔水式培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；AB135-S电子天平（±0.1g）：瑞士梅特勒-托利多公司；MFS-3A-250-K不锈钢多联过滤系统：广东环凯微生物科技有限公司；采样瓶：500mL带旋塞的广口采样瓶；培养皿：直径90mm，北京陆桥技术股份有限公司。
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滤膜法-粪大肠菌群的测定
1、适用范围
本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。
用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。
2、原理
滤膜是一种微孔性薄膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。
3仪器：
滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹
3、培养基和试剂
本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。
M-FC培养基：
胰胨 10g
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 12.5g
胆盐三号 1.5g
1%苯胺蓝水溶10ml
1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml
蒸馏水 1000ml
制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。
储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。
加热溶解前，加入 1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。
如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。
4、步骤
水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。
理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。
滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。
将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。
培养：使用M-FC 培养基。
培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使已用M-FC 培养基饱和的无菌吸收垫。
将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。
将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，经24h ±2h 培养。
若用恒温水浴培养，则需用防水胶带封每个平皿，将培养皿重叠封入防水塑料袋或容器内，浸没在44.5℃±0.5℃恒温水浴中。
在培养时间内，装培养皿的塑料袋必须用重物坠于水面之下，以保持所需的严格温度，所有已制备的培养物都应该在过滤后30min 内浸入水浴内。
5、 结果计算
粪大肠菌群菌落在M-FC 培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪肠菌群菌落呈灰色、淡黄色或无色。
正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择作用，在M-FC 培养基上很少见到非粪大肠菌 菌落。
必要时可将可疑菌落接种于EC 培养液，44.5℃±0.5℃培养24h ±2h ，如产气则证实为粪大肠菌菌群。
计数呈蓝或蓝绿色的菌落，计算出每1L 水样中含有粪大肠菌群数。
粪大肠菌群菌落数（个/L ）=)1000ml 过滤水样量（群菌落数滤膜上生长的粪大肠菌。