第五章微生物药物产生菌的菌种选育
微生物菌种的选育方法
微生物菌种的选育方法菌种选育Loremreferentibus（英语：Strain selection 日语：ひずみの选択法语：la sélection des souches 俄语：Штаммвыбор 德语：Stammselektion ）微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。
菌种用途广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。
自然选育自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。
自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。
采样筛选的菌种采集的对象以土壤为主，也可以是植物、腐败物品和某些水域等。
土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物，故土壤往往是首选的采集目标。
微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。
富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。
纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中本身含有许多种类的微生物。
所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。
平板分离法由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。
如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。
稀释分离法在溶液中再加入溶剂使溶液的浓度变小。
亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。
浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
食品微生物 第5章 微生物遗传变异与菌种选育第二节
携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为 转导噬菌体。
普遍性转导
细菌转导的二种类型：
特异性转导
1、普遍性转导（generalized transduction）
通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段 DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍 性转导。 (1) 意外的发现
保藏期 3-6 月
1-2 年 1-10 年 5-15 年
菌种保藏机构
ATCC采用的菌种保藏法：
（ American Type Culture Collection ，美国典型菌种保藏中心）
冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 CCCCM采用的菌种保藏法：
（ China Committee for Culture Collections of Microorganism， 中国微生物菌种保藏委员会）
转化（transformation）
转化：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段, 并与其染色 体同源片段进行遗传物质交换，使受体细胞获得新的遗传性 状的现象。
转化因子
吸附吸收
受体细胞 高1000倍 感受态
整合
转化子
(2) 转化过程
供体(strR)
ds DNA
感受态受体(strS) 酶解与吸收单链
将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合 为一个新细胞的技术。
五、基因工程技术用于工业菌种改良
基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。将含 目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受 体细胞并使之扩增、表达的过程。
•目的基因 •载体选择 •体外重组 •导入细胞 •筛选 •鉴定
分离、合成、逆转为cDNA、PCR扩增等 质粒、噬菌体、病毒
选育菌种的方法
选育菌种的方法一、引言菌种的选育是微生物学研究中的重要环节，它对于促进农业、食品工业、医药领域的发展具有重要意义。
本文将介绍一些常用的选育菌种的方法，包括传统的筛选方法和基于分子生物学的筛选方法。
二、传统的筛选方法1. 随机筛选法随机筛选法是最常用的菌种选育方法之一。
其步骤包括：从自然环境中收集样品，如土壤、水体等，将样品制成适宜的培养基，然后进行培养。
在培养过程中，通过观察菌落的形态、颜色、生长速度等特征，筛选出具有特殊性状或功能的菌株。
2. 生理选育法生理选育法是根据菌株的生理特性进行选育的方法。
通过调节培养条件，如温度、pH值、氧气浓度等，筛选出适应特殊环境的菌株。
例如，有些菌株能够在高温或低温环境中生长，有些菌株能够在酸性或碱性环境中生长，这些菌株可以被应用于相关领域。
3. 抗性筛选法抗性筛选法是利用抗生素或其他抑制性物质来筛选菌株的方法。
通过将菌株培养在含有抗生素或抑制性物质的培养基上，只有具有抗性的菌株才能够生长并形成菌落。
这种方法可以筛选出具有抗生素抗性、耐酸碱或耐高温的菌株。
三、基于分子生物学的筛选方法1. PCR筛选法PCR筛选法是利用聚合酶链反应(PCR)技术来筛选菌株的方法。
通过设计特异性引物，扩增目标基因片段，然后通过电泳分析扩增产物，筛选出具有特定基因的菌株。
2. 基因克隆筛选法基因克隆筛选法是将目标基因插入表达载体中，然后转化到宿主菌中，通过观察宿主菌的表型变化来筛选菌株。
例如，将具有抗性基因的载体转化到宿主菌中，只有转化成功的菌株才能够生长在含有抗生素的培养基上。
3. 荧光筛选法荧光筛选法是利用荧光蛋白标记目标基因，通过观察菌株产生的荧光信号来筛选菌株。
例如，将荧光蛋白基因与目标基因融合，将融合基因转化到宿主菌中，通过观察菌株产生的荧光信号来筛选具有目标基因的菌株。
四、总结菌种的选育是微生物学研究中不可或缺的一环。
传统的筛选方法包括随机筛选法、生理选育法和抗性筛选法，它们通过观察菌株的形态、生长特性和抗性等来筛选菌株。
《菌种的选育》PPT课件
1.抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。
2.抗性菌株的产量实验 3.真正抗性和溶原性的区别
2.5.3 噬菌体的防治 噬菌体的危害：引起发酵液变稀,
引起菌丝体变形,消解,发酵终产物积累 停止甚至下降. 怎样防治? 1.正确判断 2.普及有关噬菌体的知识 3.选育抗噬菌体菌株 4.消灭噬菌体 5.收集和保存噬菌体
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂 生物诱变剂 噬菌体 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
2.4.2.1 诱变育种的一般步骤见 (p38) 整个流程主要包括:诱变和筛选. 诱变育种中的几个注意问题 1.出发菌株的选择
出发菌株标准:产量高、对诱变剂的 敏感性大、变异幅度大。
待处理的菌悬液应考虑微生物的生理 状态、悬液的均一性和环境条件。一般要 求菌体处于对数生长期，并采取一定的措 施促使细胞处于同步生长,这样有利于变 异率提高得到很好的重现性。
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
自然突变有两种情况：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
自然选育在工业生产上的意义
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变
营养缺陷性:微生物经诱变剂处理, 由于基因突变,失去了合成某种物质 的能力,不能在基本培养基上生长需 要补加一定种类的有机物质后才能 生长.
2.6.1 细菌的杂交育种
A-B+Lac-SMrT1s
A+B-Lac+SMsT1r
A-B+Lac-SMrT1s A-B-Lac+SMsT1r A+B+Lac+SMrT1r A+B+Lac+SMsT1s
微生物的菌种选育
理想的工业发酵菌种应符合以下要求：⑴遗传性状稳定⑵生长速度快，不易被噬菌体等污染⑶目标产物的产量尽可能接近理论转化率⑷目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离⑸尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并且有利于产物分离⑹培养基成分简单、来源广、价格低廉⑺对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感⑻对溶氧的要求低，便于培养以及降低能耗一、从自然界获得新菌种的步骤分离微生物新种的具体步骤大体可分为采样、增殖、纯化、性能测定。
采样菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园数根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。
豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。
各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物以及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。
增殖才采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。
纯化常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为两个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。
另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。
具体操作方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微镜操作装置进行单细胞挑取。
性能测定菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。
二、基因突变和微生物菌种选育基因是在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段，每个基因约有1000个碱基对。
基因是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是指DNA序列）。
（生物工程）微生物菌种选育实验
微生物菌种选育一、实验目的1．了解诱变育种的基本原理。
2．学习用诱变育种筛选高产菌株的基本方法。
二、实验内容：1、蛋白酶产生菌枯草芽孢杆菌的诱变选育2、淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌的诱变选育三、实验原理自然界中分离所得的野生菌株其发酵活力一般很低，必须经过人工选育得到突变株，或通过细胞或基因工程操作成为工程菌后才能用于工业化生产。
突变可自发产生，也可诱发产生，但自发突变的频率往往很低，而诱发突变可大大提高突变频率。
所谓诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使其突变频率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。
诱变可由化学或物理因素引起，其中紫外线是一种最简单、最常用的物理诱变剂，它能使DNA 链中两个相邻的嘧啶核苷酸形成二聚体而影响DNA的正常复制，从而造成基因突变。
诱变育种时应遵循以下几个原则：(1)选择简便有效的诱变剂；(2)挑选优良的出发菌株，如生产中选育过的自然变异菌株，或是有利性状多的菌株；(3)处理单孢子或单细胞悬液，以使诱变剂接触均匀，避免长出不纯菌落；(4)选用合适生理状态的细胞，细菌一般以对数期为好，孢子以稍加萌发后为好；(5)选用合适的诱变剂量，凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量就是最适剂量，对质量性状的诱变拟采用高致死剂量(95％~99％的致死率)，而对产量性状，一般认为正变常出现在偏低剂量(75％~80％的致死率)中；(6)利用复合处理的协同效应，两种或多种诱变剂先后或同时使用，或同一种诱变剂重复使用；(7)设计和采用高效筛选方案；(8)创造和利用形态、生理与产量间的相关指标，以提高筛选效率。
物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。
一般用于诱变育种的物理因子有快种子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。
紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80％左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。
第五章微生物的遗传变异与菌种选育复习题知识讲解
第五章微⽣物的遗传变异与菌种选育复习题知识讲解第五章微⽣物的遗传变异与菌种选育复习题⼀、名词解释1.遗传型（genotype）遗传型⼜称基因型，是指某⼀⽣物个体所含有的全部遗传因⼦（基因组）所携带的遗传信息。
它是⼀种内在的可能性或潜⼒，只有在适当的环境条件下，通过⾃⾝的代谢和发育，才可将遗传型转化成现实的表型。
2.表型（phenotype）表型是某⼀⽣物体所具有的⼀切外表特征和内在特性的总和。
它是遗传型在⼀定环境下通过⽣长和发育后得体现，故是⼀种现实性（具体性状）。
3.变异（variation）变异是⽣物体在某外因或内因的作⽤下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变，其特点是群体中，以极低的概率出现（约10-9-10-5），性状变化幅度⼤，且变化后的新性状是稳定的、可遗传的。
4.饰变（modification）饰变是⼀种不涉及遗传物质结构或数量变化，只发⽣在转录、转译⽔平上的表型变化。
其特点是整个群体中⼏乎每⼀个体都发⽣同样的变化；性状变化的幅度⼩；饰变后的性状是不遗传的。
5.基因（gene）基因是⽣物体内的最⼩遗传功能单位，其本质是⼀段核苷酸序列，它能编码多肽链（通过mRNA）、tRNA或Rrna.6.操纵⼦（operon）操纵⼦是原核⽣物特有的基因形式，由三种功能上密切相关的基因组成，包括结构基因、操纵基因和启动基因。
7.结构基因（structure gene）结构基因是决定某⼀多肽链⼀级结构的DNA模板，它通过转录和转译机制可指导多肽链的合成8.遗传密码（genetic code）DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸序列称为遗传密码，其信息单位是密码⼦（核苷酸三联体）9.质粒（plasmid）直⽴式⼀类游离于核基因组外，具有独⽴复制能⼒的⼩型共价闭合环状dsDNA分⼦（cccDNA）。
10．F质粒（F plasmid）F质粒⼜称F因⼦或致育因⼦。
是⼤肠杆菌等细菌决定其性别并有转移能⼒的质粒。
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➢ 结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其抗性水平高的变 株，可解除反馈抑制而提高产量。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•五、根据产物特点而设计实验
b-内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗 菌作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味 着提高浓度的b-内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性， 即得到了高产菌株。
中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟 虫等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%的化学农 药用量。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
杂交和转基因
杂交是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太 远。这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这 个，骡子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是 在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。
•步骤：出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。
•诱变育种两个主要的环节：诱变(induction)、筛选(screening)
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
❖ 出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液 ❖ 诱变剂的选择：简便有效 ❖ 诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质 ❖ 诱变剂量的选择
•
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丘成桐, 2010 沃尔夫数学奖
第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物， 是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的 开发和理论研究方面已走到了世界的前列。
•恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差 距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂 交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的 遗传基础是什么？
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
• 2004年1月13日，沃尔夫农业奖由中国的袁隆平与美国 康奈尔大学的塔克斯莱(Steven Tanksley)分享，以表彰他们 “对杂交水稻所做出的开创性研究和发现杂交优势的基因原 理”。 袁隆平从实践及推理中突破了水稻为自花传粉植物而无 杂种优势的经典观念的束缚, 成为继陈省身(沃尔夫数学奖)及 吴健雄(沃尔夫物理学奖) 之后第三个中国人。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•代谢工程正被运用于涉及抗生素生物合成的代谢旁 路的操纵。产生菌的生物化学和生理学的知识也提供 了直接改变代谢的合理基础。有可能通过测量前体和 中间产物的代谢流以及鉴别限速步骤以用作遗传操作 的靶点。通过分析可将代谢流指向所需的代谢产物并 消除不必要产物的生物合成。
•这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。这种 理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开 发产生深远的影响。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•菲律宾的国际水稻研究所已开发出的“金大米”， 通过转基因技术让水稻制造β胡萝卜素(维生素A的前 体), 有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏 症。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•时间
•1943 •1943 •1943 •1945 •1955 •1971 •1977 •目前
•青霉素诱变史
•发酵单位(U/ml)
•100 •250 •500 •～850 •～8000 •～2万 •～5万 •5～10万
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
转基因在本质上不同 。以BT（Bacillus thuringiensis产生的 可抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害） 为例，没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。 这个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗 传物质传递的现象，但是很少，也不可预期。
自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
生物塑料
•Bohmert等在拟南芥中同时表达了来自细菌的分别编码3-酮硫 裂解酶(3-ketothiolase) 、乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetacetylCoA reductase) 和PHA合成酶(PHA synthase)的三个基因，构 建了PHB的生物合成途径，使得转基因拟南芥能够大量产生本 来没有的PHB，叶片中的含量达到鲜重的4%(约为干重的40%)。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
科学地看待问题：基于科学知识，而非基于逻辑推论和 有选择性的所谓常识
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•经典育种的黄金时代已经过去，现在以及未 来属于遗传工程。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•现代生物技术在微生物药物育种中的应用
理性菌种选育(Rational strain improvement)
•是指在对微生物药物的分子水平的装配、催化、调节等 机理透彻了解的基础上,有针对性地进行育种研究。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•代谢工程(metabolic engineering)
•代谢工程是指运用重组DNA技术通过对微生物细胞内 的酶、转运和调节等功能进行操作以提高细胞活性的现 代生物技术。主要用于有价值的化合物的研究和开发， 在能源、原材料 、治疗用品的研究和开发等方面也起着 重要的作用。运用于药物的研发是一个新兴的领域。
•微生物的潜力是无穷的。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、 辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态”后生产 出来的，是“人定胜天”的结果。
•我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
从此，利用各种物理的和化学的手段进行人工诱 变的工作在世界范围内广泛开展起来。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•突变株的筛选方案的设计
➢ 高产突变株的筛选：
化合物抗菌活性的琼脂块法
➢ 形态突变株的筛选：
去除色素，孢子等
➢ 自身耐药突变株的筛选ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 产量越高，对自身的抗性就越强
➢ 营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制
•自发突变因素: ❖ 宇宙射线 ❖ 环境中的低浓度物质 ❖ 温度的改变
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•自发突变的机理之互变异构效应假说
•腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亚氨基形式出现， 而鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的第六位可以酮式或烯醇式出现。平 衡一般倾向与氨基和酮基配对，即DNA双链一般以AT ,GC为主。
第五章微生物药物产生 菌的菌种选育
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2020/12/11
第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•基因突变是一切突变的内因。
•任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生 菌遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产 量和性质。
•微生物的生理条件、培养条件、发酵条件等在育 种发面也有着重要作用。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•浅蓝菌素(cerulenin) 通过抑制聚酮体的前体 (也是脂肪酸 前体)小分子酸类的合成而抑制聚酮体类抗生素的产生，因 此筛选在适当浓度的浅蓝菌素琼脂平板上的生长菌落即可 能获得高产菌株。
•将道诺霉素产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生长 后，长出的菌落大多数因抗生素的生物合成被抑制而表现 为无色，呈现红色的即为产生抗生素的菌落，这样获得高 产菌株的机率就得到提高。
以模式菌株S. lividans建立了一个代谢流分析模型， 目标是阐明次级代谢产物碳源分布的关系，对初级碳 代谢进行操作以提高其抗生素的产生。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
• A. 提高微生物药物的单位产量
➢增加限速酶所编码的基因的拷贝数：增加限速酶的拷 贝数可能增加抗生素的产量。
• 2005.3, 英国剑桥先正达种子公司(Syngenta Seeds)报 道了第二代转基因“金大米” 胡萝卜素(防止失 明)含量增加了20倍。”
•国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量， 以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中， 大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•如果A以亚氨基形式出现，在DNA合成到达这一位置的 瞬间，通过DNA多聚酶的作用，新合成的DNA链上的 相对位置就是C，而不是T 。
如T以稀有的烯醇式形式出现，则错配G，而不是A 。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•经典(常规)育种：诱变育种 •诱变育种(induced mutation):利用物理或化学诱变剂 (mutagen)处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率 大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方 法，从中挑选少数符合目的的突变株(mutant)，以供生 产科研之用。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•S. clavuligerus中自半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸产生头孢菌素
C
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
➢ 引入抗性基因
•自身抗性的增加意味着更多抗生素的生成，如将氨基糖 甙类抗生素的抗性基因 氨基糖苷-6-N-乙酰转移酶 基因转化至卡那霉素和新霉素产生菌，转化子对多种氨 基糖甙类抗生素的抗性增加，而且卡那霉素和新霉素的 产量提高了2-6倍。
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第五章微生物药物产生菌的菌种选育
•金大米
•从香叶基焦磷酸到b－胡萝卜素的生物合成需要 八氢番茄红素合成酶基因、植物八氢番茄红素脱 饱和酶基因、－胡萝卜素脱饱和酶基因和八氢番 茄红素环化酶基因。