腺相关病毒操作手册--汉恒生物
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
汉恒生物-病毒载体操作安全手册
病毒载体操作安全手册引言根据W HO生物安全手册对感染性微生物的相对危害程度制订的危险度等级的划分标准。
病毒的危险度为 4 级，它对个体和群体的危险均高，通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。
所以我们需要制定一定的安全注意事项，包括设备的要求、操作人员的防护、操作的规范性以及废弃物的处理等，以避免潜在的危险。
一、病毒房设备要求我们知道细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。
目前超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。
细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。
病毒房的设备在普通细胞房的基础上要求更高，尤其是其无菌操作设备。
(一)无菌操作区1、无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。
理想的无菌操作室应划为三部分：1（1）更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。
（2）缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。
（3) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。
无菌操作间的空气消毒：紫外线灯。
2、二级生物安全柜：生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
（二）孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。
孵育一般可在恒温培养箱内进行。
（三）制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备，如条件有限，可以在操作区进行。
（四）储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。
汉恒腺病毒载体操作手册
6
汉恒生物公司地址：上海市徐汇区斜土路
E-mail:service@
1175 号 15 楼
T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
5118bp
GFP
(NotI ) (NcoI ) (NcoI )
pUC ori
SV40 PolyA LoxP
HindIII
[ SacI SalI
Amp r pUC ori
SacII
XbaI(456)
ITR
ITR
1
(NdeI )
(NdeI )
NheI(1384)
pHB Ad-U6-RFP 4993bp
1
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1175 号 15 楼
T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达 红色荧光蛋白（RFP）。
3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜 的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM 操作手册目录第一章简介 1 3.2AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第二章应用重组腺病毒的长处 2 第四章主要流程 4第三章 AdEasyTM 技术 3 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 43.1 技术概略 3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB 培育基Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒MCSMultipleCloningSite 多克隆位点AdVAdenoviralVector 腺病毒载体MinMinute 分钟AmpAmpicillin 氨苄青霉素MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) 感染复数β-Gal β-Galactosidase - 半β乳糖苷酶mRNAMessengerRNA 信使 RNAbpBasePair 碱基对MWCOMOIecularWeightCut-offBSABovineSerumAlbumin 小牛血清白蛋白PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳cDNAComplementaryDNA 互补 DNA PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液cccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNA PFUPlaqueFormingUnit 空斑形成单位CPECytopathicEffect 细胞病理效应piPostInfection 感染后CsClCesiumChloride 氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus 增殖性腺病毒DMEMDulbecco’ sModifiedEagleMediumDMEM 培育基RITRRightInvertedTerminalRepeat 右边反向尾端重复DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠DTTDithiothreitol 二硫苏糖醇TBETrisBorate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸乙酸EtBrEthidiumBromide 溴化乙锭TCID50TissueCultureInfectiousDose5050% 组织培育感染剂FBSFetalBovineSerum 胎牛血清量HrHour 小时TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白ITRInvertedTerminalRepeat 反向尾端重复TETris/EDTATE 溶液KanKanamycin 卡那霉素wtWildType 野生型kbKilobases 千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5- 溴KDaKiloDaltons 千道尔顿-4-氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷第一章简介此刻基因输送技术的发展日益复杂，一些治疗药物（生长激素、扰乱素、抗病毒和抗癌复合物）和诊疗性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
汉恒生物CRISPR protocol-2质粒构建和建系
---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系
汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各 种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务
说明
lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢 病毒载体，cas9和sgRNA表达框在同一各载 体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签， 载体包含Puromycin抗性基因，适合建系。 验证sgRNA活性的时候也适合顺转；包装成 慢病毒适合常规细胞系的建系。构建非常 方便。
oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考） ）
仅作参考
病毒包装体系
包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish， 6x106 293T）
4 μg 3 μg 1 μg lentiCRISPR v2-gDNA plasmid psPAX2 packaging plasmid pMD2.G envelope plasmid
单克隆的挑取---单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）
（293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用）。如果编辑效率50%，推荐分两 块plate即可，最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系；或 者铺到100 mm dish里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成 活的细胞系如，但是挑取的单克隆偶尔不纯，有时需要重新亚克隆）。
目的细胞系的感染/转染
转染 （2 g plasmid/60 mm dish，细胞密度60-80%）
【v2=lentiCRISPR v2，下同】
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汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System 中，生产具有感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A ，E4 等基因）大部分由pHelper 质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
AAV-293细胞是HEK293细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。
野生型AAV 基因组由病毒rep 和cap 基因（分别编码AAV 复制和包装相关的基因）及位于两侧的表达和包装必须的顺式作用元件——反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeats ，ITRs ）组成。
在AAV Helper-Free System 中，rep 和cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒载体中。
在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep 和cap 基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。
由于不再需要活的辅助病毒，AAV Helper-Free System 提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。
图2. AAV Helper-Free System 腺相关病毒系统汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 3三、重组腺相关病毒载体不同血清型研究发现 A A V 具有多种血清型，各种不同血清型的 A A V 载体的主要区别是 衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。
目前汉恒生物 在包装腺相关病毒时有 9 中不同的 AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不同 组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见表 1。
血清型组织亲和性AAV1 肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织 AAV2 中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，AAV3 肌肉，肝脏，肺，眼 AAV4 中枢神经，肌肉，眼，脑AAV5 肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺AAV6 肺，心脏 AAV7 肌肉，肝脏AAV8 肝脏，眼，中枢神经，肌肉AAV9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经表1. 9种不同血清型AAV 对各组织器官细胞的亲和性四、AAV 病毒包装(一) AAV-293细胞的冻存汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 4随着传代的次数增加，AAV-293 细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉细胞培养上清液，加入PBS 洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM ，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM ，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000 rpm/min ，5min 。
去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO ）重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml 。
6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。
保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
（二）AAV-293 细胞的传代当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养基。
（三）AAV-293 细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 51、设置温度为37~42℃的水浴。
2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。
3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000 rpm/min ，5min 。
4、去掉上清，加入5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6 cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37℃、5% CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。
给细胞换一下培养基。
以后每天观察细胞生长情况。
（四）AAV 包装和浓缩1. 质粒扩增构建好的AAV 载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提， 浓度大于1ug/ul ，A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒。
推荐使用Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。
2. 传AAV-293细胞将培养AAV-293 细胞T75 瓶中的培养基吸净，加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37 度培养箱中3-5min ，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37 度水浴中预热的10％ DMEM ，移液枪用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。
之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％ DMEM ，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共4 大格，每大格16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n 万/mL 细胞浓度。
传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000 万/T75；若第三天转染，铺350-400 万/T75。
每瓶T75 加10mL 10％DMEM 培养基。
转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。
转染前无需换培养基。
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 63. 做脂转complex注：Lipofiter TM 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考Lipofiter TM 说明书。
4. AAV 病毒收毒：病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。
可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。
1) 准备一个干冰乙醇浴（将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴）和37°C 水浴；2) 将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml 的离心管中。
收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；3) 1000 rpm/min ，离心3 分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS 重悬；4) 将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C 水浴中反复转移，冻融四次。
每次融解后稍加震荡。
注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。
5. AAV 病毒浓缩：1) 10,000 g 离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。
2) 将两次收集的上清混合在一起，用 0.45um 滤器过滤除杂质3) 加入 1/2 体积的 1M NaCl ，10% PEG8000 溶液，混合均匀，4度过夜 4) 12,000 rpm 离心 2h ，弃上清，病毒沉淀用适量的 PBS 溶液溶解，待完全溶解后 用 0.22um 滤器过滤除菌。
5） 加入 Benzonase 核酸酶消化去除残留的质粒DNA （终浓度为50 U/ml ）。
合上管盖，颠倒几次以充分混合。
在37 °C 孵育30 分钟；6） 用 0.45 μm 过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV 病毒。
6. AAV 的纯化1） 向病毒浓缩液中添加固体 CsCl 直到密度为1.41 g/ml （折射率为1.372）；试剂名称 试剂数量 载体质粒 5ul(1.0ug/ul) 包装质粒 5ul(1.0ug/ul) 辅助质粒5ul(1.0ug/ul)汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 72） 将样品加入到超速离心管中，用预先配好的 1.41 g/ml CsCl 溶液将离心管剩余空间填满；3） 在 175,000 g 下离心24 小时，以形成密度梯度。