腺病毒中文操作手册
GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒 产品说明书(中文版)
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS60071.1 v.A GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂是一种旨在通过非离子去垢剂裂解细胞，然后化学沉淀的技术处理，以获得不含宿主细胞裂液中任何成分包括残余蛋白和核酸的高纯度腺病毒的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于野生型腺病毒、腺病毒相关病毒（AA V）、各种亚型的腺病毒以及其它实验用病毒等的纯化。
可以直接用于扩增分析、西方杂交分析、基因疫苗和基因疗法等各种后续实验。
产品即到即用，性能稳定，严格无菌，无核酶污染，操作简便，产物纯度极高，重复性好，回收效率高达99％。
技术背景感染复数（multiplicity of infection；MOI），即平均每个细胞感染病毒的数量，决定病毒效价（滴度）。
通常人胚胎视网膜911细胞或人胚肾293细胞的MOI为5－10 PFU/细胞。
化学沉淀技术是理想的快速纯化小量或大量腺病毒的方法。
其腺病毒回收效率达99％，纯度达80％以上。
尤为重要的是其操作安全，无需超速离心、核酶使用、树脂处理，可以获得优于其它提取方法的高度纯化的腺病毒产物。
产品内容GENMED裂解液（Reagent A）毫升GENMED沉淀液（Reagent B）毫升GENMED保存液（Reagent C）毫升GENMED过滤柱套产品说明书1份保存方式保存GENMED保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器台式离心机：用于沉淀感染细胞涡旋震荡仪：用于混匀微型台式离心机：用于分离腺病毒实验步骤1．根据细胞的MOI，计算用于病毒感染所需的细胞数，要求总量达到VP2．准备适量的（5至10个）cm2细胞培养瓶的细胞铺板3．直至生长到％铺满率4．病毒感染5．感染后天，显微镜观察：细胞呈现圆形，％细胞脱落6．小心移取所有培养瓶的细胞培养液到毫升锥形离心管7．放进 ℃台式离心机离心分钟，速度为g8．小心抽掉上清液9．用细胞刮脱棒分别刮下所有细胞培养瓶的细胞10．全部合并到到个毫升锥形离心管11．放进 ℃台式离心机离心分钟，速度为g12．小心抽去上清液13．加入毫升GENMED裂解液（Reagent A）14．涡旋震荡秒15．室温下静置分钟16．加入微升GENMED沉淀液（Reagent B）到细胞悬液底部17．涡旋震荡秒18．移取微升细胞悬液到GENMED过滤柱19．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为g（或RPM；例如eppendorf 5415）20．小心取出GENMED过滤柱21．继续移取剩余微升上述细胞悬液到GENMED过滤柱22．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为g（或RPM；例如eppendorf 5415）23．扔掉GENMED过滤柱24．加入微升GENMED保存液（Reagent C），混匀25．放进℃冰箱里保存注意事项1．本产品为10次操作2．所有操作均须无菌状态下进行3．操作时，须戴手套4．严格遵守病毒操作安全规范5．操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头6．GENMED沉淀液（Reagent B）配比优化7．纯化病毒产物，避免反复冻融8．病毒效价（滴度）取决于感染量和感染复数9．本公司提供系列腺病毒试剂产品和外包服务质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定无核酶污染3．本产品经鉴定纯化程度高4．本产品经鉴定无宿主细胞污染杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
上海杰美基因医药 GENMED 重组腺病毒转染试剂盒产品说明书(中文版)
上海杰美基因医药科技有限公司杰美品牌大师品质GMS60036 v.A GENMED重组腺病毒转染试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED重组腺病毒转染试剂是一种旨在通过强烈的阳离子脂质体介导载体，帮助腺病毒基因组质粒或腺病毒载体穿梭质粒DNA轻易通过病毒包装细胞的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种病毒质粒DNA（例如pJM17或pBHG10等）转入多种类型的贴壁型病毒包装培养细胞系（例如人胚胎视网膜911细胞或人胚肾293细胞等）。
可以被用于稳定转染或暂态转染。
产品严格无菌，即到即用，无核酶污染，配比优化，操作简捷，性能稳定，转染效率明显。
技术背景LipofusinX为带有精胺基团强负电性的脂质体介导载体，其基团具有超强的穿膜能力，血清干扰因素无损于携带外源性DNA高效进入细胞内。
产品内容GENMED清理液（Reagent A） 毫升GENMED转染液（Reagent B） 微升GENMED强化液（Reagent C） 微升GENMED保存液（Reagent D） 毫升产品说明书 1份保存方式保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备质粒DNA：用于转染的目标DNA病毒包装细胞（例如911细胞或293细胞等）：用于目标DNA转染的宿主细胞1.5毫升离心管：用于转染液和DNA操作的容器胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于转染后的细胞培养实验步骤转染实验开始前，移取微升GENMED清理液（Reagent A）到无菌的毫升离心管，然后加入微升GENMED转染液（Reagent B），再加入微升GENMED强化液（Reagent C），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀，成为转染工作液。
然后进行下列操作。
1．准备个cm2细胞培养瓶里的病毒包装细胞（例如911细胞或293细胞等）2．在转染前小时，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离细胞一次3．细胞铺满率达％（细胞）4．移取微升GENMED清理液（Reagent A）到无菌的毫升离心管5．方法一：（双质粒共转染）分别加入微升用户需转染的腺病毒载体穿梭质粒DNA（微克）和微升腺病毒基因组质粒DNA（微克），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀方法二：（单一线性质粒转染）加入微升用户需转染的重组腺病毒线性载体DNA（微克），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀6．用微升枪头一滴一滴缓慢加入DNA混匀物到转染工作液里，再用枪头轻轻上下抽吸混匀7．混匀后，在室温下静置分钟，期间轻轻混匀数次8．同时小心抽掉细胞培养瓶里的培养液9．轻轻加入毫升℃预热的GENMED清理液（Reagent A）10．即刻小心抽掉GENMED清理液（Reagent A）11．重复实验步骤和一次12．轻轻加入毫升GENMED清理液（Reagent A）到培养瓶里13．轻轻混匀含有DNA的转染工作液，即刻轻轻缓慢加入微升到细胞培养瓶里14．轻轻摇动细胞培养瓶，使其混匀15．放进℃细胞培养箱，孵育小时（注意：参见注意事项9）16．小心抽掉含有DNA的转染工作液（注意：参见注意事项10和11）17．加入毫升用户自备的完全细胞培养液18．放进℃细胞培养箱，孵育过夜19．以后每隔天小心抽掉细胞培养瓶里的培养液20．小心加入至毫升用户自备的完全细胞培养液21．转染后天，刮下细胞培养瓶里的细胞22．移入到毫升锥形离心管23．放进台式离心机离心分钟，速度为g24．小心抽去上清液25．加入毫升GENMED保存液（Reagent D）26．放进℃冰箱里保存或即刻进行病毒上清制备以及后续感染注意事项1．本产品为10次操作量2．整个操作须无菌操作3．操作时，须戴手套4．注意病毒操作安全5．操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头6．建议使用高度纯化且无内毒素的载体DNA7．建议一次操作，同时进行5个以上25cm2细胞培养瓶的转染，确保足够获得重组腺病毒量8．根据用户实际情况，建议使用空载体对照或报告基因标记对照9．孵育时建议将培养瓶密封，以防或避免转染工作液蒸发10．更换液体时，须小心，以防细胞松动或脱落11．如果转染孵育后，出现较多细胞松动和脱落，直接加入5毫升用户自备的完全细胞培养液，继续孵育24小时后，进行更换12．通常转染后2周内，不会出现明显的空斑形成或细胞病理效应（CPE）13．本产品提供的成分配比优化14．如果转染不理想，可以适当调整转染液、强化液和DNA用量15．本公司提供系列腺病毒试剂产品和外包服务质量标准1．本产品经鉴定性能长期稳定2．本产品经鉴定转染效率高使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33。
2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44。
1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1。
1 克隆的一般原则44。
1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54。
2.1 共转化的一般原则54。
2。
2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64。
4 AdEasyTM重组子转染QBI—293A细胞6 4.4。
1 细胞铺板64。
4。
2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85。
1 QBI-293A细胞培养85.1。
1 QBI—293A细胞的初始培养85。
1.2 QBI—293A细胞的维持培养和增殖8 5。
1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2。
1 感染QBI—293A细胞95。
2.2 病毒空斑形成95.2。
3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105。
4.1 X-Gal染色11 5。
5 重组腺病毒的筛选和纯化115。
5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5。
2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5。
3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145。
5。
6 免疫测定145。
5。
7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI—293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5。
7.1 不连续密度梯度离心175.7。
2 连续密度梯度离心175.7。
3 病毒溶液去盐和浓集175。
8 病毒滴度测定185。
8。
1 O。
D。
260 nm (VP/ml) 195。
8。
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）1、目的及适用范围该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿3、操作步骤3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒防治知识宣传手册
腺病毒防治知识宣传手册1. 什么是腺病毒？腺病毒是一种DNA病毒，在自然界中分布广泛。
易引起人体呼吸、消化和泌尿等多系统感染，以呼吸道感染较为常见。
目前已知的人腺病毒有A-G共7个组，60多个血清型。
55型腺病毒是由人11型和14型腺病毒重组产生的新型病毒，属于B组B2亚组，普通人群因缺乏免疫力，所以普遍易感。
2. 腺病毒有什么危害？腺病毒引起的急性呼吸道感染、急性角膜结膜炎等可导致人群暴发或流行。
病人多以轻症为主，表现出发热、咳嗽、咽痛、头痛和全身不适等症状，少数有恶心、腹泻。
大部分经过治疗后能够康复。
3. 什么季节易出现55型腺病毒感染暴发流行？冬春季节气温较低，人群多在室内活动，环境相对密闭，通风不畅，易于病毒传播。
因此，冬春季容易出现55型腺病毒感染暴发流行。
4. 腺病毒的传染源是什么？腺病毒感染者和隐性感染者是主要传染源。
潜伏期一般3～8天，潜伏期末至发病急性期传染性最强。
5. 人是如何感染腺病毒的？主要通过空气飞沫传播，如病人打喷嚏或咳嗽传染给健康人。
密切接触（手-鼻）传播也是重要传播途径，如用脏手揉眼睛、鼻子等也可感染。
6. 哪些人容易感染腺病毒？各个年龄人群均可感染腺病毒，但婴幼儿、老年人以及免疫功能低下者较容易感染。
集体生活的幼儿、学生或新兵由于生活环境封闭聚集也容易发生群体性感染。
7. 腺病毒有什么药物可以预防和治疗？疫苗预防：4型和7型腺病毒有口服疫苗，效果较好。
但近年流行的55型腺病毒是一种新型重组病毒，目前尚无针对性疫苗。
药物治疗：目前无特效治疗腺病毒的药物，可口服抗病毒类药物进行预防。
发病后主要采取对症治疗。
8. 55型腺病毒感染与普通感冒、流行性感冒有什么不同？55型腺病毒感染多引起肺部改变，普通感冒多伴有明显的鼻塞、流涕、打喷嚏等上呼吸道症状，胸片无异常，可区别于55型腺病毒感染。
流感多有发热、头痛、乏力，伴肌肉酸痛等全身症状，与55型腺病毒感染不易区分，需经实验室检测确诊。
ips操作指南-腺病毒版本
IPS操作指南第四版IPS操作指南--腺病毒版本IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。
现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。
2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。
用Lentivirus和retrovirus 建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。
Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。
一、实验材料腺病毒OSKM四因子：Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC；病毒扩增细胞：293A细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。
二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。
耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。
三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则54.2.2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板64.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心175.7.2 连续密度梯度离心175.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法205.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。
为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。
重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。
迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。
1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。
此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。
腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。
但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。
昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。
现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。
重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。
AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。
这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。
AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。
第二章应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。
腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。
2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。
腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。
腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA：为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。
此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。
这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。
5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。
大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。
而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。
在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7. 能在悬浮培养液中扩增：293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。
大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。
最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
第三章AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。
在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。
将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。
在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。
相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。
在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。