柠檬酸发酵过程说明
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
柠檬酸发酵工艺
下补水接种。 • 严格无菌操作。
• 5.补水接种 • 避免淀粉回生，并且减少染菌几率。
• 6.装盘进室
• 曲醅疏松，不可压实，厚度6~7cm，高温 天气5cm左右
（五）发酵规程
• 1.薄层发酵法 • 品温30~35℃左右 • 发酵终点由酸度决定，48h后每12h测一次，
五、溶解氧的控制
产酸速率与溶氧分压成正比。 菌体生长中，有呼吸作用， 在对数生长期需氧量达到最高峰 进入产酸期后，氧的消耗降低 到一个较低的水平
溶解氧浓度的控制
• 2.置换法发酵
• 采用低糖而营养较丰富的培养液先培养菌 盖，菌盖形成后再更换发酵培养基一次或 数次。
• 培养液糖浓度50g/L，室温34~36℃、培养 液32~34 ℃，第二天室温32~34 ℃，一般 接种40h可形成紧实菌盖，排掉培养液，补 充发酵培养基（第一次置换），室温降至 30~32℃，发酵48~60h在排去发酵液，进 行第二次置换，以此循环。
• 优点：
• （1）发酵体系是均一的液体，传热传质良好，不 存在死区；
• （2）设备占地面积小，生产规模大；
• （3）发酵速率高，采用预培菌丝球接种只需 50~70h；
• (4)产算率高，产柠檬酸几乎接近理论产率，菌体 生成量少；
• （5）发酵设备密闭，杂菌污染可能性小，管理方 便；
• （6）完全机械化操作，并可以实现自动控制，劳 动强度低，劳动生产率高；
• （7）发酵副产物少，有利于产品提取，所得产品 质量高。
（一）黑曲霉柠檬酸深层发酵条件控制
一、营养要求
• 根据柠檬酸发酵机制，黑曲霉能够大量积累柠檬酸的条件， 提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对磷、锰、铁、锌等无机 盐物质处于低水平。
柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵机制柠檬酸生产分发酵和提取两部分。
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
现多采用通用发酵罐。
它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。
发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力，并有良好的密封性。
除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。
例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过不断变异和选育得到的。
菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
柠檬酸发酵机理
通过调整发酵温度和pH值，找到最适 宜的发酵条件，以提高柠檬酸的产量 和降低能耗。
产物的分离与纯化技术改进
分离技术
采用新型的分离技术，如超滤、纳滤、反渗透等，实现柠檬酸的高效分离和纯 化，降低分离成本。
纯化技术
采用结晶、离子交换、吸附等纯化技术，进一步提高柠檬酸的纯度，满足不同 应用需求。
细菌
某些细菌如柠檬酸杆菌、 氧化杆菌等也可以进行柠 檬酸发酵。
微生物的代谢途径
葡萄糖代谢
微生物将葡萄糖通过糖酵解途径 转化为丙酮酸，这是柠檬酸发酵 的起始步骤。
丙酮酸代谢
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下 转化为草酰乙酸，再经过三羧酸 循环转化为柠檬酸。
乙酰CoA的合成
在柠檬酸发酵过程中，乙酰CoA 是重要的中间代谢产物，可以用 于合成脂肪酸等物质。
厌氧发酵
微生物在厌氧条件下，将葡萄糖或其他糖类转化 为丙酮酸，再经过一系列反应生成柠檬酸。
3
好氧发酵
微生物在好氧条件下，通过糖酵解途径将葡萄糖 转化为丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬 酸。
柠檬酸发酵的分类
黑曲霉发酵
黑曲霉在好氧条件下进行发酵，通过糖酵解途径将葡萄糖转化为 丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬酸。
产物提取与精制
过滤分离
将发酵液进行过滤，分 离出菌体和未消耗的原
料。
离子交换
利用离子交换剂吸附柠 檬酸离子，与其他离子 进行交换，实现柠檬酸
的分离。
浓缩结晶
将分离出的柠檬酸溶液 进行浓缩和冷却，促使
柠檬酸结晶析出。
干燥与包装
将结晶的柠檬酸进行干 燥和包装，得到符合标
准的柠檬酸产品。
05 柠檬酸发酵的优化与改进
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
柠檬酸发酵工艺
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层
的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
存在一定的毒性（微毒），特别是阳离子型聚丙 烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。
医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯 类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等）， 天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨 胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。
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当然，聚丙烯酰胺在食物中的含量远远高于化妆品中的 含量，人体对于丙烯酰胺的摄入也多来自饮食。
（3）混凝
凝聚和絮凝统称为混凝。
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型 高分子絮凝剂，同时具有降低胶粒双电层电位和产生 吸附桥架的双重机理
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量 的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过 滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等， 最常用的是硅藻土（特点：质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附、 稳定 ）。
絮凝——在胶体或悬浮体内加入极少量的可溶性高分子化合 物，使水或液体中悬浮微粒集聚变大，或形成絮团，从而加快 粒子的聚沉，达到固-液分离的目的。 凝聚——指在电解质作用下，胶体和分散系双电层压缩、ζ电 位破坏、电性中和而脱稳，并聚集为絮状颗粒的过程。 凝聚过程就是胶粒聚集成较大颗粒的过程。 聚沉——胶体的微粒在一定条件下发生聚集的现象。向胶体 中加入盐时，其中的阳离子或阴离子能中和分散质微粒所带的 电荷，从而使分散质聚集成较大的微粒，在重力作用下形成沉 淀析出。这种胶体形成沉淀析出的现象称为胶体的聚沉。
柠檬酸制备
柠檬酸制备
柠檬酸是一种重要的有机弱酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 原料准备：以薯干粉为主要原料，这是我国80%以上柠檬酸生产的基础原料。
2. 调制浆料：将薯干粉调制成浓度为18%～22%的浆料，以适合发酵过程的需要。
3. 灭菌发酵：将调制好的浆料送入已经经过蒸汽灭菌（0.2MPa，40～60分钟）的发酵罐中，进行黑曲霉深层发酵。
4. 中和处理：发酵结束后，使用碳酸钙对发酵液进行中和处理，以得到柠檬酸钙。
5. 酸解精制：通过硫酸酸解将柠檬酸钙转化为柠檬酸，然后进行精制，以去除杂质。
6. 浓缩结晶：将精制后的柠檬酸溶液进行浓缩，随后通过结晶过程得到柠檬酸晶体。
7. 干燥包装：最后将结晶出的柠檬酸进行干燥处理，并包装储存。
总的来说，整个制备过程需要严格控制各个环节的条件，以确保产品质量和生产效率。
柠檬酸作为一种无色晶体，无臭，易溶于水，其溶液显酸性。
在生物化学中，它是柠檬酸循环（三羧酸循环）的中间体，这一循环发生在所有需氧生物的新陈代谢中。
因此，柠檬酸不仅是工业上的重要化学品，也是生命科学中的关键物质。
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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思考题
1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点， 如何控制？
2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产 率的意义。
（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分 子乙酰辅酶A，也就是需要 1.5分子的葡萄糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的
（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸
乙醇乙酸
3醋酸 1柠檬酸 生成的柠檬酸一半转化为 异柠檬酸 酵母N源耗尽后开始烷烃 发酵，低浓度AMP抑制 NAD-异柠檬酸脱氢酶的 活性，柠檬酸大量合成并 积累。此时顺乌头酸水合 酶催化反应平衡为：柠檬 酸：异柠檬酸：顺乌头酸 = 90：7：3。细胞质中积 累大量异柠檬酸。
存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加 上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设 备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现
1940年，Krebs: TCA；
1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途 径所有酶；
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧 系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。
二、柠檬酸及其盐的应用概况
食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱 臭剂； 医药工业：
化学工业： 美容品、化妆品
三、我国柠檬酸生产现状 生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界
第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产 厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物 化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏 中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华 源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特 点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻 遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内 不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不 可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起： ①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸 逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊 二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的不产生 ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。 ②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成 乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节， 增强了合成柠檬酸的能力。 ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱 氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
第四章 柠檬酸发酵机制
重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物 合成的代谢调节机制。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。
第一节 概述
一、柠檬酸简介
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是 生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三 羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。 无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙 醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中 存在TCA循环。
二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡 萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化 脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙 酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。
抑制，使EMP畅通无阻。 （2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水
合酶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：
1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好 2. 显色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。
3. 不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬 酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。 4. 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使 TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。 （为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸 （GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着 体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在 以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环 被阻断或减弱。
(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由 丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。 即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用 下固定化CO2生成草酰乙酸为主。
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。