3种植物花螺原体的分离及其基本特性-生物谷-生物医药门户
西兰花种子中硫苷酶解产物萝卜硫素提取分离和结构鉴定
ＩＩ
／ｓ＼／＼／＼彩、
本课题以西兰花种子为原料，研究了西兰花种子中硫苷的酶解条件及 其产物萝卜硫素的提取、分离纯化工艺，并鉴定其结构，为开发萝卜硫素 相关产品奠定了基础。
通过研究溶剂、超声、脱脂对萝卜硫素提取的影响，确定了提高样品 中萝Ｉ－硫素含量的提取工艺：西兰花种子一粉碎一酶解８ｈ一冷冻干燥一丙 酮超声浸提６０ｍｉｎ－－－＊纱布过滤一滤液浓缩一水定溶一高速离心一Ｏ．２２Ｉ－ｔｍ水 系滤膜过滤一ＨＰＬＣ分析。
ｓｔｕｄｉｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｕｎｄｗｏｒｋ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ，ｄｅｆａｔｔｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｏｆ ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ ｉｎ ｂｒｏｃｃｏｌｉ ｓｅｅｄ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｈａｖｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ
ｆｏｒ ６０ ｎｌｉｎｕｔｅ．Ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ａｃｅｔｏｎｅ ｅｘｔｒａｃｔ Ｗａｓ ｆｉｌｔｅｒ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｉｎ ｖａｃｕｏ ｔｏ
ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎ ｏｉｌ ｏｎ ａ ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ（３０℃）．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｗａｓ ｗａｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ａ
浙江丁＝商大学硕士学位论文
行，～般是种子／水（ｗ／ｖ）＝ｌ：２（ｇ／ｍＬ）比较好。 对于萝ｂ硫素样品的分离纯化工艺研究，首先用硅胶柱层析初步分离
硫苷酶解产物，然后再用Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ．２０凝胶柱层析纯化萝卜硫素粗样， 最后用制备型高效液相色谱仪制备萝卜硫素样品，收集萝ｂ硫素的馏分， 冷冻干燥后再用ＨＰＬＣ检测其纯度，结果表明样品中萝卜硫素的纯度达到 了９２．８＋１．２％。
花卉病原菌分离与鉴定方法
花卉病原菌分离与鉴定方法花卉作为美化环境、增添生活情趣的重要组成部分，常常受到各种病原菌的威胁。
为了及时有效地控制花卉病害，研究人员开发了一系列花卉病原菌分离与鉴定方法。
本文将探讨几种常用的花卉病原菌分离与鉴定方法，并介绍其原理及操作步骤。
一、菌落分离法菌落分离法是一种常见的花卉病原菌分离与鉴定方法。
首先，我们需要准备一定量的花叶或茎秆样本，并将其在无菌条件下切割成适当大小的块状。
然后，将这些样本分别接种在含有适当培养基的培养皿上，并进行孵育。
在孵育过程中，病原菌会生长并形成单独的菌落。
最后，我们可以通过分离单个菌落并进行纯化培养，得到纯种病原菌。
二、生物学特性鉴定法生物学特性鉴定法是通过病原菌的生长特性、形态学特征、生理生化特性等进行鉴定。
例如，通过观察病原菌的生长速度、菌落形态、色素产生能力等特点，可以初步确定其属于某一类别的病原菌。
此外，对于一些常见的病原菌，还可以进行特定的检测，如利用氧化酶试验、酸碱反应等方法进行鉴定。
三、分子生物学鉴定法分子生物学鉴定法是一种基于病原菌的遗传信息进行鉴定的方法。
通过从病原菌中提取DNA，并利用PCR或其他分子生物学技术进行扩增和分析，可以确定病原菌的分类和亲缘关系。
例如，利用特异性引物扩增病原菌的保守基因片段，然后通过凝胶电泳等方法分析扩增产物的大小和形态，可以得到病原菌的分子生物学信息，进而进行鉴定。
四、免疫学鉴定法免疫学鉴定法是利用病原菌与宿主的免疫反应进行鉴定的方法。
通过检测植物对病原菌的抗体反应，可以确定病原菌的种类和数量。
这种方法主要包括血凝试验、免疫电镜等技术。
通过与已知病原菌的免疫反应进行比较，可以鉴定未知病原菌的种类。
综上所述，花卉病原菌分离与鉴定是花卉病害研究的重要内容。
我们可以利用菌落分离法、生物学特性鉴定法、分子生物学鉴定法和免疫学鉴定法等多种方法进行鉴定。
通过这些方法的应用，我们可以更好地了解花卉病原菌的种类、特性和病害发生规律，为花卉病害的防治提供科学依据和技术支持。
蜜蜂螺原体病的流行特点和防治方法
蜜蜂螺原体病的流行特点和防治方法1976年，美国马里兰州首次发现蜜蜂螺原体。
1984年，南京农业大学在中国大陆也从爬行的蜜蜂体中分离到蜜蜂螺原体。
下面就是蜜蜂螺原体病的流行特点和防治方法的介绍：流行特点1.地理分布蜜蜂螺原体病分布较为广泛，首先在浙江省发现并传播蔓延至江苏、四川、江西、安徽、河南、古林、福建、陕西等省市。
调查表明，转地放蜂的蜂场，发病宰高，病情严重，而定地饲养的蜂场，发病率低，病情较轻。
在江浙—带，春季4一5月份为发病高峰期。
在北方，华北一带，发病高峰期为6—7月份。
2．传播途径用饲喂和微量注射法接种蜜蜂螺原体，均可使健康蜂感病，证明该病是通过消化道侵入蜂体引起蜜蜂死亡的。
在蜂群内，被污染的饲料和蜂具是该病的传染源。
据国外报道，从植物花上也分离到蜜蜂螺原体。
经39蜂疗网试验证明，花螺原体对蜜蜂有致病性。
3．该病与其他病害的相关性蜜蜂螺原体单独感染蜜蜂发病的较少见，而常与其他病害如孢子虫病、麻痹病等混合发生，病情较重，死亡率较高，蜂群群势下降严重。
因此，在防治时，应采用综合措施。
防治方法室内测定表明，蜜蜂螺原体对抗生素类药物敏感，但由于该病通常与孢子虫病、病毒病混合感染，因此只用抗生素防治效果较差，必须采取综合防治措施。
1．药物防治春季在对蜂群进行奖励饲喂时，加入保蜂健、抗病毒一号和磺胺类药物预防。
发病初期，再根据病原种类应用相应的药物对症治疗(用量和方法参照孢子虫病、麻痹病和美洲幼虫腐臭病防治药物部分)。
2．加强饲养管理经常保持蜂群内有充足的饲料贮备，越冬饲料要求优质、量足。
春季注意对蜂群保温并做到通气良好，以防止巢内湿度过大，秋季对巢脾和蜂具进行消毒(4％甲醛溶液消毒方法见化学消毒部分)。
3．选育抗病蜂种淘汰抗病力差的蜂种，选育抗病力强的蜂群培育新蜂王，保持蜂群群势，增强抗病力，更换陈旧巢脾和老弱蜂王。
观赏植物病害病原—原核生物
◆ 植原体属（ Phytoplasma ） 1. 鉴定特征：新设属，寄生于韧皮 部组织中，菌体无细胞壁，正常为 圆球形或椭圆形，因无细胞壁，在 寄主体内运行时易变形，呈丝状、 杆状、哑铃状。大小为80~800 nm， 外层质膜厚8~10nm。发病适温 20~25℃。难培养，在特殊平板培养 基上菌落小，呈“煎蛋”状，引起黄 化和丛枝。
土壤杆菌属Agrobacterium 棒状杆菌属
黄单胞杆菌属Xanthomonas Corynebacterium
食酸菌属Acidovorax
棒形杆菌属Clavibacter
伯克氏菌属Burkholderia 短小杆菌属
嗜木杆菌属Xylophilus 拉尔氏菌属Ralstonia 欧氏菌属Erwinia
第二节观赏植物病害病原—原核生物
4. 侵染途径 ①自然孔口：水孔、气孔、皮孔 （寄生性较强：假单胞菌和黄单胞 菌）。 ②伤口：非专性寄生菌、伤口寄生 物（寄生性较弱）、微伤口（植原 体等）。
第二节观赏植物病害病原—原核生物
5. 病害诊断
（1） 症状诊断
① 常见植物细菌性病害（症状、喷菌）
② 难培养的菌原体引起的病害
合果芋细菌性叶斑病 (Xanthomonas campestris)
除中脉叶片所有组织都受害。开始时出现水渍状、黄色 的小斑，随着病斑扩大病斑变为黄褐色至红色，后期病 斑变为黑色，有一圈黄色的晕圈。
第二节观赏植物病害病原—原核生物
◆ 欧文氏菌属（Erwinia） 1. 鉴定性状：G-，短杆状，大小 0.5~1.0×1.0~3.0µm；周生鞭毛；菌 落灰白色；好气，部分兼厌气；最 适温度27~30℃，>pH7.0。
Curtobacterium 节杆菌属Arthrobacter 红色球菌属 Rhodococcus
第三章-植物病原原核生物及其病害
2. 植物青枯病(Ralstonia solanaceareum)，各 大洲都有发生，但主要在热带、亚热带及 部分温带地区温暖、酷热、潮湿、多雨的 条 件下严重为害。中国的黄河流域及其南 方各省均有发生，但以长江流域以南为害 最重。
番茄青枯病
3. 植物软腐病，由几种欧文氏菌 (Erwinia)引起的病害，主要为害十字 花科作物，也为害禾本科及其它栽培 植物，世界各国及中国南北方都有发 生。
（E. amylovara）是我国的对外检疫对象。
玉米细菌性枯萎病 (Erwinia stewartii)
6. 黄单胞菌属（Xanthomonas）1939，Dowson
菌体直杆状，0.4-0.7x0.7-1.8m, 单极生鞭 毛；绝对好氧；G-；菌落一般为黄色、光滑或 粘稠；产生黄单胞菌色素（Xanthomonadins）； G+C 63-71mol%。
畸形根据症状、侵染和传播特点 •2、接种实验（如利用菟丝子传染长春花） •3、电镜下观察菌原体 •4、分子生物学技术（如PCR） •5、菌原体可以穿过细菌过滤器 •6、注射四环素以后，初期病害的症状可以隐退消 失或减轻；对青霉素不敏感。
A~B：螺旋形；C：球形
菌体短杆状，0.2-0.5x1.0-4.0m, 单生，无 鞭毛；兼性好气性；G-, 无芽孢；营养要求苛刻， 琼脂上不能生长，需要血清蛋白或焦磷酸铁等 （需要可溶性铁），喜欢在木质部中活动故称 为木质部难养菌（Xylem fastidious bacteria, XFB）。
• 已知仅一种：木质部难养菌（X. fastidiosa）,引
大白菜软腐病 Erwinia carotovora subsp. carotovora
4. 梨火疫病
• Erwinia amylovora (Burrill)Winslow et al.引
【临床微生物实验】_螺旋体(spirochetes)
梅毒以外密螺旋体引起疾病的鉴别
梅毒以外的其他两个亚种的密螺旋体：在菌体 形态、抗原、DNA同源性方面与梅毒螺旋体基本 相同，梅毒的血清学试验这两个密螺旋体引起 疾病的患者也阳性。
梅毒以外的其他两个亚种密螺旋体引起的疾病： 在我国极少见，主要发生在潮湿、温暖、经济 落后地区。
诊断标准：主要依据感染部位的解剖学位置、 传播模式和患者的年龄
所致病：
钩体轻重病者者自爆限发性严，重轻肝微肾发肺热损害（大W多e如il病此）
典型分两阶段：初期或菌（败）血症期（持续4－7d) 第二阶段（免疫阶段）：脏器损害等 钩体尿
致病因子：黏附素、内毒素、溶血素、细胞毒因子
微生物学特性
形态染色:菌体细长丝状圆柱形（6－12μm×0.10.2μm)，一端或两端弯曲成钩状，有2 条内鞭毛（轴丝），运动活泼。 形态观察：最好用暗视野或相差显微镜 Fontana镀银染色：棕褐色 革兰染色：阴性，但着色微弱
用已知VDRL抗原检测血清中抗脂质 抗体的凝集反应
非梅毒螺旋体抗原血清试验
• VDRL试验 VDRL抗原：由0.03%心磷脂 0.21%卵 磷脂和0.90%胆固醇组成 该抗原需新鲜配制 不能保存 待检血清需灭活 需要使用显微镜观察结果 主要用于脑脊液检查
非梅毒螺旋体抗原血清试验
• USR试验 是VDRL试验的改良 USR抗原：基本成分与VDRL试验相同
广州医科大学临床微生物检 验教研室学习
概念：螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈
螺旋状，运动活泼的原核细胞型微 生物。
与细菌相似处：具有细菌细胞的所有内部
结构，如细胞壁含脂多糖和胞壁酸、原核、 二分裂繁殖、对抗生素敏感等。
与原虫相似之处 ：
体态柔软，胞壁与胞 膜之间绕有弹性轴丝， 借助它的屈曲和收缩 能活泼运动，易被胆 汁或胆盐溶解。
植物病原微生物
植物病原微⽣物1 植物病原物定义植物病原物，⼜叫植物病原菌或病原微⽣物，是包括细菌、真菌、病毒，类病毒等在内，经传播侵⼊植物后能引起疾病的传染性微⽣物或⽣物性病原媒介。
植物病原物常能⼲扰植物正常的⽣理⽣化功能，并使植物在⽣理或组织结构上出现种种病理变化，引起植物病害，危害植物健康，影响作物产量。
2 与植物的关系植物病原物侵害的对象是植物，绝⼤多数病原物与植物之间都是⼀种寄⽣关系[2]。
⼀种⽣物从其他⽣物体内获取养分的能⼒称为寄⽣性（parasitism），这种⽣物被称为寄⽣物（parasite），被寄⽣的植物称为寄主（host）< data-bigsrc='https:///app/a/200698/2048_1536_20200225151207-1315850408.png' data-loaded='true' data-observer='true' data-src='https:///app/a/200698/2048_1536_20200225151207-1315850408.png' style='color: inherit;background-repeat: no-repeat;background-position: 50% 50%;background-size: contain; display: block;width: 232px;height: 174px;background-color: rgb(249, 250, 251);background-image:url('https:///mmbiz_png/y9qN1iauRKicUyIyibCvtniaMeLXYLdVgZEWvpTRGc4coicE6UCowicXFA2R8jnv9QCAPStib6YoCNgcQelmGA2iakl4Sw/640? wx_fmt=png');' title='点击查看⼤图'>⽟⽶叶⽚锈病受害状⼀般将寄⽣物分为两类，即活体营养⽣物（biotroph）和死体营养⽣物（necrotroph）。
植物病原原核生物
– 基因突变：DNA内部的变异
人工诱变：辐射或化学诱变
自然突变：突变频率1/1x104～1010
– 基因重组：不同来源的DNA重组
接合 (conjugation)
转导 (transduction)
转化 (transformation)
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（四）分类地位与主要类群
细菌在生物分类系统中的地位
马铃薯环腐病 番茄溃疡病
2021/5/8
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棒形杆菌－马铃薯环腐病
2021/5/8
症状：
– 病叶边缘上卷、脉 间变黄、枯焦
– 病薯维管束变褐、 腐烂
– 挤压病薯有菌脓从 维管束溢出
随病薯越冬
切刀传播
伤口侵入
韧皮部扩展 32
棒形杆菌－番茄溃疡病
2021/5/8
• 症状：
• 叶片脉间变黄 • 茎部产生暗褐色
• 通过四环素类抗生素处理，病株内菌体数量 下降，病害随之减轻；
• 青霉素无效。
之后，发现200多种植物病害与菌原体有关
2021/5/8
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1. 植原体 (Phytoplasma)
原称作类菌原体 (Mycoplasma-like organism,
MLO)
菌体物细胞壁，圆形、椭圆形、有时为丝状或 哑铃形
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（四）分类地位与主要类群
Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology, 9th Ed., 1994) &
International Journal of Systematic
Bacteriology
原核生物界分为四个门：
1. 薄壁菌门：细胞壁薄，G-
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3种植物花螺原体的分离及其基本特性-生物谷-生物医药门户3种植物花螺原体的分离及其差不多特性于汉寿，阮康勤，纪燕玲，陈永萱，王志伟(南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京210095)摘要：【目的】调查我国植物花上的螺原体的存在，搜集我国的螺原体资源，并研究它们的差不多生物学特性。
【方法】常规螺原体分离、培养方法，应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观看螺原体形状，按照16S rDNA和ITS序列构建系统发育树研究螺原体分离菌株可能的分类地位。
【结果】分不从油菜(Brassica napus)、杜鹃(Rhododendron simsii)、红花酢浆草(Oxalis corymbosa)3种植物花表分离到4株螺原体CNR-1和CNR-2、CNA-1、CRW-1，对其形状、部分生理生化特性及分子生物学特性进行了初步研究。
这4株螺原体在R-2液体培养基中生长良好，都能通过孔径为0.22 m的微孔滤膜；在R-2固体培养基上呈圆形或颗粒状菌落，菌落直径约50~600 m；在生长的某个时期可呈典型的螺旋状，菌体直径为37.04~370.40 nm，长度约0.89~11.88 m；它们都能利用葡萄糖作为碳源，不能利用尿素；在不含胎牛血清的R-2培养基中，它们都不能生长；菌株CNR-1、CNA-1能强烈代谢精氨酸，而C NR-2和CRW-1不能代谢精氨酸；在氨苄青霉素钠浓度高达2000 U/m L的R-2培养基中，分离菌株生长良好。
按照16S rDNA序列构建的系统发育树显示，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1与蜜蜂螺原体Spir oplasma melliferum聚类较近，而CRW-1与S. clarkii聚类较近；按照I TS序列构建的系统发育树显示，CRW-1形成一个单独的分枝，其它3个菌株仍与S. melliferum聚类。
【结论】以上结果初步表明，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1极有可能是Spiroplasma melliferum，而CR W-1可能是一个新的螺原体种，但还需要血清学试验进一步验证。
关键词：螺原体；生物学特性；油菜；杜鹃；红花酢浆草中图分类号：Q939.34 文献标识码：A 文章编号：0001-620 9 (2008) 09-1141-06螺原体(Spiroplasma)是硬壁菌门(Firmicutes)柔膜菌纲(Mollicu tes)的一类螺旋状、无细胞壁的原核生物，它们基因组小（0.78~2.2 2 Mb），是能独立生活和自我复制的最简单的原核微生物[1]。
作为一类重要的微生物资源，由于其形状结构和营养代谢的特点，螺原体常作为研究生物膜和运动的模式生物受到关注[2, 3]。
绝大多数螺原体分离自昆虫和扁虱，在几种植物体内或花表也分离到螺原体[4]。
有些螺原体对宿主有致病性，如螺原体Spiropla sma apis和S. melliferum导致蜜蜂（Apis spp.）“五月病”（May disease）和“爬蜂病”，S. citri，S. kunkelii和S. phoneiceum分不引起柑橘顽固病(Citrus stubborn)、玉米矮缩病(Corn stunt)和紫苑黄化病(Aster yellow)，而大多数螺原体和宿主之间是共生(Mutualism)或互生(Commensalism) 关系[4]。
有许多研究证实花上螺原体与昆虫之间有紧密的关系，Clark 认为蜜蜂螺原体在蜜蜂体内显现和消逝的时刻与植物开花时刻一致表明花能够作为传播中间体[5]，这种估量得到Davis等的支持，后来大量植物花螺原体的发觉进一步支持了这种观点[6]。
目前一样观点认为，花上螺原体可能是携带螺原体的昆虫在取食花蜜或花粉时留下的,花仅是作为定居场所在昆虫传播中起作用，这种估量也被食叶昆虫及非虫媒花上没有发觉类似的螺原体所支持[4]。
然而，直截了当从植物花分离得到的螺原体从哪里来？在自然界中如何传播？螺原体是否在植物花上增殖？是否进入植物体内？是否对植物产生什么阻碍？这些咨询题目前尚不清晰。
国际上已有36个螺原体有效种的记录，但国内有关螺原体的研究极少[7,8]。
为获得我国的螺原体资源，并为以后进一步研究螺原体与宿主之间的相互关系，2005年3 ~7月间，我们从江苏省南京市东郊采集了大量的植物花分离得到4株螺原体，并研究了其差不多生物学特性。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试植物花和螺原体菌株：用于分离螺原体的植物花有油菜(Brassica napus)、杜鹃(Rhod odendron simsii)、红花酢浆草(Ox alis corymbosa )、牡丹(Paeona su ffruticosa)、现代月季(Rosa hybrid a)、虞美人(Papaver rhoeas)、诸葛菜(Orychophragmus violaceus)、唐菖蒲(Gladiolus hybridus)等80多种，差不多上在华东地区于3 ~ 7月间开花的植物。
用镊子随机采集盛开的花盛放于洁净的保鲜袋中，3~5朵花为一个样品，幸免用手直截了当接触样品，扎紧样品袋口后带到室内赶忙进行分离。
1.1.2 要紧试剂和仪器: DN A提取和纯化、PCR扩增所用酶和试剂同文献[9]。
Chelex-100树脂和牛心冻干粉(PPLO)购自Sigm a公司；所用暗视野显微镜为Oly mpus BH-2，透射电子显微镜为H itachi H7650。
1.2 螺原体的分离及纯化分离所用培养基是由C-3G简化后的R-2培养基[7]。
在无菌的平皿中加入5 mL左右的R-2培养基，将样品用无菌镊子取出，将花瓣分离后浸泡于培养基中，并轻轻转动2~5 min后，将浸泡过花瓣的培养基用孔径为0.45 m的微孔滤膜过滤，滤液收集于无菌的1.5 mL离心管中，于30℃静置培养；逐日观看培养基颜色变化，并用暗视野显微镜(Olympus BH-2)观看验证，连续观看一个月。
分离菌株的纯化用梯度稀释法[8]。
1.3 分离物的滤过性及对青霉素的抗性取1 mL培养物用孔径0.22 m的滤膜加压过滤，在暗视野显微镜下检查是否有菌体存在。
在R -2培养基中加入不同单位的氨苄青霉素钠以检查螺原体对青霉素的抗性[7]。
1.4 螺原体的形状及运动性观看应用负染法在电子显微镜下观看分离菌株的形状[7]。
取0.5 mL处于不同生长期的螺原体培养液，用等体积4％戊二醛（内含0.03 mol/L磷酸缓冲液，pH7.3~7.5）固定，于4℃静置1~3 d，吸一滴固定后的液体置于铜网上，静置2 min，用滤纸吸干溶液，用1.5%的磷钨酸钠溶液(pH7.0)染色40 s，再用滤纸吸干，风干后用透射电子显微镜(Hitachi H7650)观看其形状。
用暗视野显微镜观看分离菌株的运动性[7]。
1.5 螺原体的培养及其生理学特性将分离物接种到R-2液体或固体培养基中，30℃静置培养，逐日观看培养基颜色变化，并用暗视野显微镜观看分离物的密度和运动方式。
用倒置显微镜观看分离物在R-2固体培养基中的菌落形状。
在研究分离菌株对葡萄糖、精氨酸及尿素时，分不用1％的葡萄糖或精氨酸、或0.2%的尿素替代R-2培养基中的蔗糖，然后接种2 0 μL对数生长期的菌体，在30℃静置培养；在研究螺原体生长对血清需求中，取20 L对数生长期的菌体接种于不含胎牛血清的R-2培养基[7]。
30℃静置培养，连续转管培养3次以上；逐日观看培养基颜色变化，并用暗视野显微镜观看验证。
以接种R-2培养基作对比，重复3次。
1.6 螺原体的16S rDNA和I TS分析2 结果和分析2.1 植物花螺原体分离物的获得从采集到的80多种植物花进行螺原体的分离，结果从油菜(Brassica napus)、杜鹃(Rhododendro n simsii)、红花酢浆草(Oxalis cor ymbosa ) 3种植物花上分离到4个来源不同的分离物，分离物用梯度稀释法纯化3次。
获得分离物的花外表与正常花无明显差异。
分离物CNR-1和CNR-2分离自油菜花，CNA-1和CRW-1分不分离自杜鹃花和红花酢浆草的花表。
2.2 植物花螺原体分离物的滤过性、对青霉素的抗性及其它差不多特点分离菌株CNR-1、CNR-2和CNA-1在R-2液体培养基中生长繁育速度较快，30℃静置培养2 d 培养基就变色，而CRW-1生长相对较慢，培养4～5 d培养基才变色。
用暗视野显微镜观看到上述4种分离物的菌体螺旋状，在液体培养基中可作翻动式运动。
都能通过孔径为0.22 m的微孔滤膜。
在氨苄青霉素钠浓度高达2000 U/m L的R-2培养基中，分离菌株能正常繁育，生长良好。
以上结果讲明这些分离物为螺原体。
将分离菌株接种到R-2固体培养基中，30℃培养2 d（CNR-1、CNR-2和CNA-1）或4 d（CRW-1）后用倒置显微镜观看到菌落呈圆形或颗粒状，菌落直径在50~60 0 m之间变化，形状没有明显差不。
菌落大小与琼脂浓度、接种量紧密有关。
琼脂浓度低、接种量少则菌落相对较大。
在电镜下4个菌株均可见丝状螺旋形菌体，其中，CNR-1、C NR-2和CNA-1 菌株的菌体直径在0.18 m左右，一样有5~8个螺旋，CRW-1菌体直径约0.20 m，多数有5~6个螺旋，菌体中间或末段可见膨大部分(图1)。
图1 用负染法在电镜下观看4株植物花螺原体分离菌株的形状(标尺为500 nm)Fig. 1 Electron micrograph of negative-stained preparations of fo ur spiroplasma isolates.A: CNR-1; B: CNR-2; C: CNA-1; D: CRW-1. scale bars: 500 nm.2.3 分离菌株的生理特性在不含胎牛血清的R-2培养基中，分离菌株都不能生长，讲明上述植物花螺原体分离物依靠血清中的甾醇生长。
分离菌株都能利用葡萄糖作为碳源，而不能利用尿素。
在以精氨酸为唯独碳源的R-2培养基中，接种和培养CNR-1、CNA-1 2-4 d后培养基由红色逐步变成黄色，培养液仍旧保持澄清。
在暗视野显微镜下也发觉螺原体分离物密度的快速增加，螺原体呈剧烈的翻动运动；而接种和培养CNR-2和CRW-1 14 d后培养基颜色仍没有变化，而且在暗视野显微镜下也没有发觉螺原体密度的增加。
这些讲明CNR-1、CNA-1能代谢精氨酸，而CNR-2和CRW -1不能(表1)。
表1 供试菌株对血清的需求及几种物质的代谢特性Table 1 Serum requirement and other materials utilization of spi roplasma isolatesSpiroplasma isolates HostGlucosefermentationArgininehydrolysisUreahydrolysisGrowthin serum-freeSpiroplasma melliferum Apis melliferum + + --CRW-1 Oxalis corymbosa+ - --CNR-1 Rhododendron simsii+ + --CNR-2 Rhododendron simsii+ ---CNA-1 Brassica napus+ + --“+”means positive reaction, “”means negative reaction.2.3 分离菌株的系统发育学分析采纳Chelex-100法提取得到足量的螺原体总DNA，利用通用引物成功扩增出螺原体的长度约1470 bp的16S rDNA片段，利用通过Primer 5.0设计的引物也成功扩增出长度约1450 bp的ITS 片段。